Nghiên cứu thu nhận độc tố miễn dịch immonotoxin định hướng ứng dụng điều trị ung thư vú biểu hiện kháng nguyên Her2

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

NGUYỄN PHƢƠNG HOA

NGHIÊN CỨU THU NHẬN ĐỘC TỐ MIỄN DỊCH IMMUNOTOXIN ĐỊNH HƢỚNG

ỨNG DỤNG ĐIỀU TRỊ UNG THƢ VÚ BIỂU HIỆN KHÁNG NGUYÊN HER2

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2010

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

Nguyễn phƣơng Hoa

NGHIÊN CỨU THU NHẬN ĐỘC TỐ MIÊN DỊCH IMMUNOTOXIN ĐỊNH HƢỚNG

ỨNG DỤNG ĐIỀU TRỊ UNG THƢ VÚ BIỂU HIỆN KHÁNG NGUYÊN HER2

Ngành: Sinh học

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60.42.30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Lê Quang Huấn

Hà Nội - 2010

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU…………………………………………………………1

Chƣơng 1- TỔNG QUAN TÀI LIỆU......................................………………..3

1. Khái niêm, phân loại và ứng dụng của immunotoxin……………………….3

1.2. Tình hình ung thƣ vú (UTV) trên thế giới và ở Việt Nam .....................4

1.2.1.Trên thế giới ...................................................................................4

1.2.2.Ở Việt Nam .....................................................................................4

1.3 Giới thiệu ung thƣ vú……………………………………………………5

1.3.1 Khái niệm chung về bệnh UTV......................................................5

1.3.2 Nguyên nhân phát sinh ung thƣ vú.................................................6

1.3.3 Các phƣơng pháp chẩn đoán...........................................................7

1.3.4 Các phƣơng pháp điều trị................................................................9

1.4. Kháng nguyên Her2 đặc hiệu tế nào ung thƣ vú. ..................................10

1.4.1. Khái quát về kháng nguyên HER2...............................................10

1.4.2. Cấu trúc HER2 ............................................................................11

1.4.2.1 Cấu trúc gen HER2 ...........................................................11

1.4.2.2 Cấu trúc protein HER2......................................................11

1.4.2.3 Sự khuếch đại HER2 và cơ chế gây ung thƣ của HER2….13

1.5 Khái quát chung về kháng thể - Kháng thể đơn dòng.............................16

1.5.1. Cấu tạo chung của kháng thể ........................................................16

1.5.2 Kháng thể đơn dòng. .....................................................................17

1.5.3 Kháng thể đơn chuỗi - Mảnh kháng thể…………………………..17

1.5.4 Một số kháng thể đơn dòng sử dụng trong điều trị ung thƣ vú...…19

1.5.5 Kháng thể kháng HER2 gắn Melitin………………………………22

Chƣơng 2- VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUError! Bookmark

not defined.

2.1. Vật liệu ...................................................Error! Bookmark not defined.

2.1.1 Sinh phẩm......................................................................................23

2.1.2 Hoá chất.........................................Error! Bookmark not defined.

2.1.3. Thiết bị .........................................Error! Bookmark not defined.

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .......................Error! Bookmark not defined.

2.2.1. Phƣơng pháp PCR……………………………………………….24

2.2.2. Cắt bằng enzym giới hạn..............................................................26

2.2.3. Phƣơng pháp thiết kế vector biểu hiện.........................................26

2.2.4. Phƣơng pháp biến nạp..................................................................29

2.2.5. Phƣơng pháp biểu hiện protein tái tổ hợp ....................................30

2.2.6. Phƣơng pháp điện di protein trên gel polyacrylamide.................31

2.2.7. Phƣơng pháp tính sạch protein tái tổ hợp bằng cột ái lực Ni2+ ..32

2.2.8. Phƣơng pháp phân tích khối phổ .................................................33

Chƣơng 3- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...................................................36

3.1. Thiết kế vector biểu hiện pET-21A(+)mang gen mã hoá độc tố miễn dịch

hermel...............................................................................................................36

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

3.1.1. Cắt gen Hermel ............................................................................36

3.1.2.Cắt vector pET-21A(+).................................................................36

3.1.3. Gắn gen hermel vào vector pET-21A(+) và chọn dòng plasmid tái

tổ hợp………………………………………………………………………..38

3.1.4. Xác định trình tự gen hermel.

.............. ……………………………………Error! Bookmark not defined.

3.2. Biểu hiện và tối ƣu hoá biểu hiện gen hermel.

............................. ………………………….Error! Bookmark not defined.

3.2.1. Biến nạp plasmid tái tổ hợp pET-21A(+) vào tế bào E.coli

BL21(DE3).........................................................................................................Er

ror! Bookmark not defined.

3.2.2. Biểu hiện gen mã hoá độc tố miễn dịch đặc hiệu kháng nguyên

HER2 trong tế bào E. coli BL 21(DE3)………………………………………..45

3.3 Ngiên cứu điều kiện biểu hiện gen mã hoá độc tố miễn dịch đặc hiệu

kháng nguyên HER2 trong E. coli......................................................................46

3.3.1.Ảnh hƣởng của pH lên khả năng sinh tổng hợp độc tố miễn dịch

herme...................................................................................................................47

3.3.2 Ảnh hƣởng của oxi lên khả năng biểu hiện của gen mã hoá độc tố

miễn dịch đặc hiệu kháng nguyên HER2………………………………………48

3.3.3 Khảo sát nồng độ kháng sinh………………………………………50

3.3.4 khảo sát nhiệt độ nuôi cấy

……………………………………………...Error! Bookmark not defined.

3.3.5 Ảnh hƣởng của IPTG………………………………………………….52

3.3.6 Khảo sát thời gian thu mẫu……………………………………………54

3.3.7 Biểu hiện protein tái tổ hợp hermel ở các điều kiện thích hợp đã lựa

chọn…………………………………………………………………………….55

3.4. Tinh sach protein tái tổ hợp hermel, khẳng định bằng khối phổ và xác

đinh hoạt tính…………………………………………………………..............56

3.4.1 Tinh sạch protein tái tổ hợp HER2……………………………………....56

3.4.2 Phân tích khối phổ protein tái tổ hợp…………………………………….57

3.4.3 Xác đinh hoạt tính của protein hermel…………………………………...59

Kết luận và kiến nghị

………………………………………………………...Error! Bookmark not

defined.

Tài liệu tham khảo

……………………………………………………………Error! Bookmark

not defined.

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

THUËT NG÷ VIÕT T¾T

Stt Ký hiệu Tên đầy đủ

1 ADN Axit Deoxyribonucleic

2 Amp Ampicillin

3 bp Base pair (cÆp baz¬ nit¬)

4 ddNTP Dideoxynucleotide

5 dNTP Deoxynucleotide

6 EDTA Ethylen Diamine Tetra acetic Acid

7 PE Pseudomonas exotoxin

8 EtBr Ethidium Bromide

9 HRP Horseradish peroxidase

10 IPTG Isopropyl--D-Thiogalactopyranoside

11 IR Inter-repeat region (miÒn lÆp néi m¹ch b¶o tån)

12 Ka Kanamycin

13 kDa Kilo Dalton

14 LB M«i tr-êng Lauria Betani

15 DT Diphtheria toxin

16 LRR Leucine-rich repeat (®o¹n lÆp giµu leucine)

17 LTA Axit lipoteichoic

18 NASBA Nucleic acid sequence-based amplification (khuÕch ®¹i dùa trªn

tr×nh tù axit nucleic)

19 OD Optical Density (MËt ®é quang häc)

20 PCR Polymerase Chain Reaction (Ph¶n øng chuçi trïng hîp)

21 SDS Sodium Dodecyl Sulphate

22 TAE Tris - Acetate - EDTA

23 TE Tris - EDTA

24 utv ung th- vó

25 v/ph vßng/phót

26 X-gal 5-bromo - 4-chloro - 3-indolyl-  - D-galactopyranoside

Số hóa bởi Trung tâm Học Liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn