Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme cellulose từ nấm mốc và ứng dụng trong sản xuất ethanol từ vỏ quả cà phê vối (Coffea robusta) :Báo cáo tổng kết đề tài Khoa học và Công nghệ cấp trường

BỘ CÔNG THƯƠNG

ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC

KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

Tên đề tài: NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM ENZYME

CELLULASE TỪ NẤM MỐC VÀ ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT

ETHANOL TỪ VỎ QUẢ CÀ PHÊ VỐI (Coffea robusta)

Mã số đề tài: IUH.VSH16/16

Chủ nhiệm đề tài: ĐỖ VIẾT PHƯƠNG

Đơn vị thực hiện: VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ THỰC PHẨM

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 12 năm 2017

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên chúng tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Công

Nghiệp TP Hồ Chí Minh, Phòng Quản lý Khoa học và Hợp tác Quốc tế và Viện Công

nghệ Sinh học - Thực phẩm, trường Đại học Công Nghiệp thành phố Hồ Chí Minh đã

tạo điều kiện để cho chúng tôi có cơ hội để thực hiện và hoàn thành tốt đề tài này

Xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS. TS Lê Nguyễn Đoan Duy và TS. Phạm

Văn Tấn, những người đã truyền cho tôi rất nhiều kiến thức, thật nhiều kinh nghiệm và

đặc biệt là có những ý kiến đóng góp, trao đổi thật sự bổ ích. Nó như là nguồn động lực

giúp tôi luôn luôn cố gắng và phấn đấu hết mình.

Qua đó, tôi cũng muốn gửi lời cảm ơn chân thành đến các cộng sự PGS.TS. Đàm

Sao Mai, ThS. Đặng Thị Sáu, ThS. Lê Hương Thủy, TS. Trịnh Ngọc Nam, ThS. Bùi

Hồng Quân, TS. Trần Thị Huyền cùng tất cả nhân viên Phòng thí nghiệm Viện Công

nghệ Sinh học - Thực phẩm và các em sinh viên khóa 8, 9 đã hỗ trợ nhiệt tình trong quá

trình thực hiện đề tài.

Và lời cuối tôi thật sự muốn cảm ơn, xin được gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè

đã luôn động viên, chia sẻ và hỗ trợ chúng tôi hết mình.

Chúng tôi xin chân thành cảm ơn!

TÓM TẮT

Nấm mốc là nhóm vi sinh vật phát triển mạnh trong điều kiện khí hậu ở Việt Nam. Đặc biệt

trong các phế phụ liệu (giàu cellulose) từ quá trình trồng trọt và chế biến cà phê như: đất, cành

lá, thân gỗ mục, vỏ quả cà phê. Nghiên cứu này tập trung vào quá trình phân lập, tuyển chọn

chủng nấm mốc Trichoderma asperellum (từ các nguồn nêu trên) có khả năng sinh enzyme

cellulase hoạt tính cao. Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng, có 5 chủng Trichoderma phân lập

được từ quả cà phê. Trong số đó, chủng Trichoderma asperellum QT5 có khả năng sinh tổng

hợp cellulase hoạt tính cao nhất và đạt 1,17 U/mL (CMCase) sau 48 giờ nuôi cấy trên môi

trường lỏng cơ bản. Quá trình tối ưu môi trường nuôi cấy chủng nấm T. asperellum QT5 được

lựa chọn như sau: Môi trường lên men lỏng, tốc độ lắc 150 vòng/phút; thời gian nuôi cấy 7

ngày; nhiệt độ nuôi cấy 350C; pH môi trường 7.0; cơ chất cảm ứng 1% cám gạo; nồng độ dịch

chiết khoai tây là 100%; khoáng bổ sung là KCl 1,5%; nguồn nitơ bổ sung là (NH4)2SO4 0,2%.

Hoạt tính CMCase đạt được là 13,6 U/mL. Sau đó enzyme thô được tinh sạch sơ bộ bằng ethanol

(tỷ lệ enzyme : ethanol là 1 : 3,5). Kết quả tinh sạch: hoạt tính CMCase đạt 21,72 U/mL (49,59

U/mg); hiệu suất thu hồi đạt 89,43%; độ tinh sạch đạt 3,4 lần.

Vỏ cà phê là phế liệu đầu tiên được thải ra từ quá trình chế biến cà phê nhân ướt. Vỏ cà phê

tươi chiếm tới 40% trọng lượng của toàn bộ quả cà phê. Trong vỏ cà phê hàm lượng chất xơ

chiếm lần lượt là: 25,88% cellulose; 3,6% hemicellulose và 20,07% lignin. Vỏ cà phê được

xem như là một nguồn sinh khối lignocellulose lý tưởng trong việc sản xuất các sản phẩm giá

trị gia tăng (đặc biệt là sản xuất ethanol sinh học). Trong nghiên cứu này, vỏ cà phê được tiền

xử lý bới NaOH (0,2 g/g nguyên liệu) ở 1200C trong thời gian 20 phút. Kết quả tốt nhất có thể

thu được: 71,25% cellulose được giữ lại; 46,11% hemicellulose bị loại bỏ; 76,63% lignin bị

loại bỏ. Sau đó nguyên liệu đã tiền xử lý được thủy phân bởi enzyme đã thu nhận được từ chủng

nấm mốc Trichoderma asperellum QT5 với tỷ lệ enzyme là 25 FPU/g ở 500C trong thời gian

72 giờ. Toàn bộ dịch thủy phân được đem đi lên men với mật độ tế bào nấm men ban đầu là

3x108

(tế bào/mL), lên men ở 350C trong thời gian 72 giờ. Kết quả thu được hàm lượng ethanol

đạt 10,06 g/L (tương đương với 7,6 g ethanol/100 g nguyên liệu). Kết quả chỉ ra rằng, với sản

lượng vỏ cà phê dồi dào thì đây sẽ là nguồn nguyên liệu tiềm năng cho sản xuất ethanol ở Việt

Nam.

Từ khóa: Cellulase, vỏ cà phê, Coffea robusta, Trichoderma asperellum, tinh sạch, thu nhận

enzyme, cồn sinh học, tiền xử lý, thủy phân, lên men.

MỤC LỤC

DANH MỤC HÌNH .........................................................................................................i

DANH MỤC BẢNG ..................................................................................................... iii

ĐẶT VẤN ĐỀ................................................................................................................iv

1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI .........................................................................iv

2. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN ...........................................v

3. TÍNH KHẢ THI VÀ ĐỊNH HƯỚNG PHÁT TRIỂN ............................................v

4. MỤC TIÊU TỔNG QUÁT .....................................................................................v

5. MỤC TIÊU CỤ THỂ ..............................................................................................v

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .........................................................................1

1.1 GIỚI THIỆU VỀ NGUYÊN LIỆU CÀ PHÊ........................................................1

1.1.1 Giới thiệu về vỏ cà phê vối............................................................................1

1.1.2 Một số ứng dụng từ vỏ quả cà phê.................................................................2

1.1.2.1 Làm môi trường nuôi cấy vi khuẩn ........................................................2

1.1.2.2 Sản xuất dịch đạm ..................................................................................2

1.1.2.3 Chiết xuất caffeine..................................................................................2

1.1.2.4 Sản xuất phân bón hữu cơ ......................................................................3

1.1.2.5 Sản xuất một số sản phẩm khác .............................................................4

1.1.3 Khả năng kháng vi sinh vật của caffeine và phenolic có trong vỏ quả cà phê

.........................................................................................................................................4

1.1.3.1 Khả năng kháng khuẩn của caffeine ......................................................4

1.1.3.2 Khả năng kháng khuẩn của phenolic......................................................5

1.2 TỔNG QUAN VỀ ENZYME CELLULASE.......................................................6

1.2.1 Cấu trúc và tính chất enzyme cellulase..........................................................7

1.2.2 Cơ chế xúc tác của cellulase ..........................................................................9

1.2.3 Tính chất của cellulase.................................................................................11

1.3 TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ CHỦNG NẤM MỐC SINH TỔNG HỢP

CELLULASE ................................................................................................................13

1.3.1 Aspergillus niger..........................................................................................13

1.3.2 Trichoderma.................................................................................................15

1.4 GIỚI THIỆU VỀ ETHANOL SINH HỌC .........................................................17

1.4.1 Ethanol sinh học thế hệ thứ nhất..................................................................18

1.4.2 Ethanol sinh học thế hệ thứ hai....................................................................19

1.4.3 Ethanol sinh học thế hệ thứ ba.....................................................................19

1.4.4 Tình hình sản xuất ethanol trên thế giới ......................................................19

1.4.5 Sản xuất và nghiên cứu ethanol ở Việt Nam ...............................................22

1.5 TỔNG QUAN VỀ VI SINH VẬT LÊN MEN TẠOETHANOL.......................24

1.5.1 Nấm men......................................................................................................24

1.5.2 Vi khuẩn.......................................................................................................25

1.5.3 Vi sinh vật lên men sinh ethanol từ xylose..................................................26

1.6 TỔNG QUAN VỀ CÁC NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC ...........26

1.6.1 Một số nghiên cứu về sản xuất ethanol sinh học trên thế giới ....................26

1.6.2 Một số nghiên cứu về sản xuất ethanol sinh học ở Việt Nam .....................29

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................32

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ................................................................................32

2.1.1 Nguyên liệu..................................................................................................32

2.1.2 Nguồn phân lập nấm mốc ............................................................................32

2.1.3 Hóa chất .......................................................................................................33

2.1.4 Môi trường ...................................................................................................33

2.1.5 Dụng cụ........................................................................................................33

2.1.6 Thiết bị.........................................................................................................34

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................................................................34

2.2.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu..........................................................................34

2.2.2 Các phương pháp phân tích và đo đạc .........................................................36

2.2.3 Phương pháp thu thập và xử lý kết quả .......................................................44

2.3 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM.......................................................................................45

2.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát quá trình thu nhận enzyme cellulase từ nấm

mốc ................................................................................................................................45

2.3.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát quá trình sản xuất ethanol từ vỏ cà phê .47

2.3.3 Thí nghiệm 1: Phân lập một số dòng nấm mốc có đặc tính hình thái giống

nhóm nấm Aspergillus và Trichoderma ........................................................................47

2.3.4 Thí nghiệm 2: Định loại các dòng nấm vừa phân lập..................................48

2.3.5 Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng sinh tổng hợp cellulase của các dòng nấm

mốc đã phân lập.............................................................................................................49

2.3.6 Thí nghiệm 4: Khảo sát thời gian nuôi cấy nấm mốc..................................49

2.3.7 Thí nghiệm 5: Khảo sát nhiệt độ môi trường nuôi cấy nấm mốc ................50

2.3.8 Thí nghiệm 6: Khảo sát pH môi trường nuôi cấy nấm mốc ........................51

2.3.9 Thí nghiệm 7: Khảo sát nồng độ dịch chiết khoai tây bổ sung vào môi trường

nuôi cấy..........................................................................................................................52

2.3.10 Thí nghiệm 8-9: Khảo sát ảnh hưởng của cơ chất cảm ứng bổ sung vào môi

trường nuôi cấy..............................................................................................................53

2.3.11 Thí nghiệm 10-11: Khảo sát ảnh hưởng của nguồn khoáng bổ sung vào môi

trường nuôi cấy..............................................................................................................54

2.3.12 Thí nghiệm 12-13: Khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ bổ sung vào môi

trường nuôi cấy..............................................................................................................55

2.3.13 Thí nghiệm 14-15: Khảo sát ảnh hưởng của (NH4)2SO4 và NaCl đến khả

năng kết tủa enzyme cellulase .......................................................................................57

2.3.14 Thí nghiệm 16-17: Khảo sát ảnh hưởng của ethanol và acetone đến khả năng

kết tủa enzyme cellulase................................................................................................58

2.3.15 Thí nghiệm 18: Xác định thành phần hóa học cơ bản của vỏ quả cà phê vối

.......................................................................................................................................60

2.3.16 Thí nghiệm 19: Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme đến hàm lượng đường

glucose thu được sau quá trình thủy phân .....................................................................60

2.3.17 Thí nghiệm 20: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian thủy phân đến

hàm lượng đường glucose và đường khử thu được.......................................................61

2.3.18 Thí nghiệm 21: Khảo sát ảnh hưởng của mật độ tế bào nấm men đến hàm

lượng ethanol tạo thành sau quá trình lên men..............................................................62

2.3.19 Thí nghiệm 22: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian lên men đến

hàm lượng ethanol thu được..........................................................................................64

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN...................................................................66

3.1 Kết quả phân lập một số dòng nấm mốc có đặc tính hình thái giống nhóm nấm

Aspergillus và Trichoderma ..........................................................................................66

3.2 Kết quả định loại các dòng vừa phân lập dựa trên các đặc điểm đại thể và vi thể

.......................................................................................................................................67

3.3 Kết quả đánh giá khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase của các chủng nấm

mốc phân lập được.........................................................................................................70

3.4. Định danh 5 dòng nấm mốc phân lập được .......................................................73

3.5 Tối ưu môi trường nuôi cấy T. asperellum QT5 .................................................76

3.5.1 Kết quả ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ nuôi cấy T. asperellum QT5 đến

hoạt lực CMCase ...........................................................................................................76

3.5.2 Kết quả ảnh hưởng của pH môi trường và nồng độ dịch chiết khoai tây đến

hoạt lực CMCase ...........................................................................................................77

3.5.3 Kết quả ảnh hưởng của cơ chất cảm ứng đến hoạt lực CMCase .................78

3.5.4 Kết quả ảnh hưởng của nguồn nitơ và khoáng chất đến hoạt lực CMCase.79

3.6 Thu nhận chế phẩm enzyme cellulase từ T. asperellum QT5.............................80

3.6.1 Đánh giá khả năng kết tủa cellulase từ T. asperellum QT5 bằng muối

(NH4)2SO4......................................................................................................................80

3.6.2 Đánh giá khả năng kết tủa cellulase từ T. asperellum QT5 bằng muối NaCl

.......................................................................................................................................81

3.6.3 Đánh giá khả năng kết tủa cellulase từ T. asperellum QT5 bằng dung môi

ethanol và acetone .........................................................................................................82

3.6.4 QUY TRÌNH THU NHẬN ENZYME CELLULASE TỪ NẤM MỐC T.

asperellum QT5 .............................................................................................................85

3.7 Ứng dụng chủng nấm T. asperellum QT5 vào quá trình sản xuất ethanol từ vỏ cà

phê .................................................................................................................................86

3.7.1 Kết quả xác định thành phần hóa học của vỏ quả cà phê ............................86

3.7.2 Kết quả tiền xử lý nguyên liệu vỏ cà phê bằng kiềm NaOH .......................88

3.7.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme đến quá trình thủy phân ................................90

3.7.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến quá trình thủy phân ...................92

3.7.5 Ảnh hưởng của mật độ tế bào nấm men ban đầu bổ sung vào quá trình lên

men ................................................................................................................................93

3.7.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến hàm lượng ethanol thu được............94

3.7.7 Ảnh hưởng của thời gian lên men đến hàm lượng ethanol thu được ..........95

3.7.8 QUY TRÌNH SẢN XUẤT ETHANOL TỪ VỎ QUẢ CÀ PHÊ ................98

3.7.9 TÍNH SƠ BỘ CHI PHÍ SẢN XUẤT RA 100 mL ETHANOL...................99

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..............................................................100

4.1 KẾT LUẬN.......................................................................................................100

4.2 KIẾN NGHỊ ......................................................................................................100

TÀI LIỆU THAM KHẢO...............................................................................................a