Nghiên cứu quy trình chiết tách các steviol glycosides từ lá cây cỏ ngọt Stevia rebauduana Bertoni / Nguyễn Minh Hoàng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP. HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHIẾT TÁCH CÁC

STEVIOL GLYCOSIDE TỪ LÁ CÂY CỎ NGỌT

STEVIA REBAUDIANA BERTONI

MÃ SỐ: T2012.19.148

Chủ nhiệm đề tài:

ThS. NGUYỄN MINH HOÀNG

TP. HCM, Tháng 03/2015

DANH SÁCH THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU

ĐỀ TÀI VÀ ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH

Thành viên tham gia nghiên cứu đề tài:

1. ThS. Nguyễn Minh Hoàng (chủ nhiệm đề tài).

2. SV Nguyễn Thị Hoài Thanh.

3. SV Mai Yến Nhi.

Đơn vị phối hợp chính:

1. Phòng thí nghiệm Phân tích Trung tâm, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên,

Đại học Quốc Gia TP. Hồ Chí Minh.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP. HCM Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1. Thông tin chung:

 Tên đề tài: Nghiên cứu quy trình chiết tách các steviol glycoside từ lá cây cỏ ngọt Stevia

rebaudiana Bertoni.

Tiếng Anh: “Method of isolation steviol glycosides from leaves of Stevia rebaudiana

Bertoni”.

 Mã số: T2012.19.148

 Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Minh Hoàng.

 Đơn vị của chủ nhiệm đề tài: Khoa Công nghệ Sinh học - Đại học Mở TP. HCM

 Thời gian thực hiện: từ tháng 01/2013 đến tháng 07/2014 (Quyết định số 1111/QĐ￾ĐHM, ngày 27/12/2012 cho phép thực hiện trong 15 tháng)

2. Mục tiêu:

Nghiên cứu qui trình chiết tách các steviol glycoside trích ly từ lá cỏ ngọt nhằm ứng

dụng trong giảng dạy môn Thực hành chiết xuất dƣợc liệu.

3. Các điểm mới của đề tài:

 Sử dụng phƣơng pháp chiết Soxhlet với hệ dung môi ethanol 80%. Dung môi đƣợc xem

là ít gây độc cho ngƣời nghiên cứu và rẻ tiền.

 Các tác giả Nguyễn Văn Tài (2014), Abou-Arab (2010) sử dụng các loại nhựa hấp phụ

Diaion HP-20, Amberlite IR-4B… với giá thành cao để tách các tạp chất màu; nên

không có hiệu quả kinh tế. Thay thế nhựa hấp phụ, chúng tôi thực hiện các bƣớc sau:

+ Loại béo, nhựa, chlorophyl bằng ethyl acetate.

+ Chiết lỏng –lỏng nhóm steviol glycoside từ dịch nƣớc bằng n-butanol.

+ Tách và tinh chế các steviol glycoside bằng sắc ký cột với silica gel 60 (chất hấp

thu khá rẻ tiền, đƣợc dùng phổ biến hiện nay)

4. Các kết quả chính:

 Kết quả khảo sát quá trình trích ly cho thấy phƣơng pháp chiết Soxhlet với dung môi

ethanol 80% trong 15 giờ cho hàm lƣợng cao chiết tối ƣu là 2,6 % với tỉ lệ bột

lá/ethanol (1:10).

 Kết quả khảo sát sắc ký bản mỏng cho thấy hệ Chloroform – Methanol – H2O : 30 - 20

- 4) có khả năng tách đƣợc các steviol glycoside, và cho vết rõ ràng khi hiện hình với

bằng H2SO4 10 % trong ethanol.

 Kết quả sắc ký cột và nhận danh bằng phổ NMR cho thấy hợp chất cô lập đƣợc là

stevioside.

5. Sản phẩm:

 quy trình chiết tách và cô lập stevioside.

6. Hiệu quả, phƣơng thức chuyển giao kết quả nghiên cứu và khả năng áp dụng:

Hiệu quả: Stevioside là chất ngọt từ tự nhiên đã đƣợc sử dụng làm phụ gia thực phẩm bởi

nhiều nƣớc trên thế giới nhƣ Nhật Bản, Trung Quốc, Ấn Độ... Hiện nay trên thị trƣờng

chỉ có sản phẩm stevioside nhập khẩu nên chất ngọt này không phổ biến và có giá

thành cao.

Cỏ ngọt là cây bán nhiệt đới nên thích hợp với điều kiện khí hậu ở nƣớc ta. Vì vậy, việc

nghiên cứu quy trình chiết xuất stevioside mang lại lợi ích về mặt kinh tế, làm giảm giá

thành sản phẩm. Nếu chất ngọt stevioside đƣợc đƣa vào sản xuất đại trà sẽ đáp ứng

đƣợc nhu cầu của ngƣời tiêu dùng ngày càng quan tâm đến vấn đề sức khỏe, đặc biệt là

ngƣời bị bệnh tiểu đƣờng.

Phƣơng thức chuyển giao kết quả nghiên cứu & khả năng áp dụng: có thể chuyển giao quy

trình chiết tách cho:

- khoa Công nghệ Sinh học - Đại học Mở TP. HCM.

- các địa phƣơng có trồng cây cỏ ngọt.

7. Bài giới thiệu tóm tắt đề tài (< 500 từ)

Với tình hình ngày càng gia tăng tỷ lệ béo phì và bệnh tiểu đƣờng, đồng thời có những

quan ngại về đƣờng hoá học nhƣ aspartame, cyclamate, saccharin…, nhu cầu về loại đƣờng

không năng lƣợng trích ly từ thiên nhiên trở nên cấp thiết. Vì vậy, nhằm thay thế các đƣờng

tổng hợp hoá học, chúng tôi tiến hành chiết tách các diterpen glycoside từ lá cây cỏ ngọt

Stevia rebaudiana Bertoni.

 Mục đích của báo cáo này là nghiên cứu qui trình chiết tách các steviol glycoside trích

ly từ lá cỏ ngọt khô nhằm ứng dụng trong giảng dạy môn Chiết xuất dƣợc liệu.

Chúng tôi đã tối ƣu hoá 3 giai đoạn chính nhằm ly trích nhƣ sau: (i) chiết các steviol

glycoside từ lá cây cỏ ngọt; (ii) tinh chế dịch chiết ban đầu; (iii) sắc ký cột.

i. Nhằm tìm ra phƣơng pháp nhanh và hiệu quả để tách stevioside, rebaudioside A,… từ

lá và so sánh hiệu suất của nhiều kỹ thuật chiết tách khác nhau, bột lá khô đƣợc chiết

bằng 2 phƣơng pháp: ngâm chiết ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ, và chiết Soxhlet dùng

methanol, ethanol, hay nƣớc cũng nhƣ hỗn hợp dung môi với nƣớc. Phƣơng pháp

Soxhlet với hệ dung môi ethanol 80% cho kết quả tối ƣu.

ii. Tinh chế dịch chiết nƣớc khỏi tạp chất hữu cơ bao gồm sắc tố màu (chlorophylls,

xanthophylls), nhựa,… bằng cách kết hợp nhiều phƣơng pháp nhƣ kết tủa tạp chất

bằng hydroxide nhƣ Ca(OH)2 và chiết phân đoạn các glycoside với ethyl acetate and

n-butanol.

iii. Phân đoạn chiết butanol đƣợc sắc ký cột với silica gel 60 (0,063 - 0,200 mm) bằng hệ

dung môi rửa giải chloroform - methanol với độ phân cực tăng dần bằng cách tăng tỷ

lệ methanol (từ 5, 10, 20 và 30%) cho ra stevioside.

8. Bài giới thiệu tóm tắt đề tài (tiếng Anh)

With the increased incidence of diabetes and obesity and also due to growing concern

over the safety of some chemical sweeteners such as aspartame, cyclamate, saccharin, etc., the

need for natural non-calorie sweeteners with acceptable taste and relatively safe is

demanding. Diterpene glycosides extracted from the leaves of Stevia rebaudiana Bertoni

plants are used in food and beverages as substitutes for synthetic sweeteners.

 The purpose of this research is to study the process of extraction and isolation of

steviol glycosides from the dried Stevia rebaudiana Bertoni leaves for teaching subject

“Naturals Product Extraction”.

We have optimized 3 stages: (i) extraction of steviol glycosides from the leaves of Stevia

rebaudiana Bertoni; (ii) purification of the primary extract; and (iii) chromatographic column

separation.

i. To develop a rapid and effective methodology for the extraction of stevioside and

rebaudioside-A from S. rebaudiana leaves and to compare yields using different

extraction techniques, dried and powdered leaves were extracted by 2 method:

conventional maceration (at room temperature for 24 h), and Soxhlet extraction using

methanol, ethanol and water as single solvents as well as in binary mixtures. Soxhlet

method using ethanol 80% give optimum yield.

ii. Purification of the aqueous extracts from organic impurities consisting of pigments

(chlorophylls, xanthophylls), resins,… procedures combining several methods such as

precipitation of impurities by hydroxides Ca(OH)2 and fractional extraction of

glycosides with ethyl acetate and n-butanol.

iii. The butanol fraction was subjected to column chromatography over silica gel 60

(0,063 - 0,200 mm) by gradient elution with chloroform - methanol mixtures

containing increasing proportions of methanol (i.e. 5, 10, 20 and 30%) to give

stevioside.

Ngày 31 tháng 03 năm 2015 Ngày 30 tháng 03 năm 2015

Lãnh đạo đơn vị Chủ nhiệm đề tài

Ngày tháng năm 2015

Cơ quan quản lý xác nhận

KT. HIỆU TRƢỞNG

PHÓ HIỆU TRƢỞNG

MỤC LỤC

Danh mục bảng ........................................................................................................... i

Danh mục chữ viết tắt ................................................................................................. i

Danh mục hình ........................................................................................................... ii

ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................... 1

PHẦN 1: TỔNG QUAN .......................................................................................... 3

I. CHẤT NGỌT THAY THẾ ĐƢỜNG ................................................................ 3

1. Chất ngọt nhân tạo ........................................................................................ 3

2. Chất ngọt tự nhiên.......................................................................................... 6

II. ĐẠI CƢƠNG CỎ NGỌT ................................................................................. 7

1. Nguồn gốc và phân loại ................................................................................. 7

2. Đặc điểm thực vật học ................................................................................... 7

3. Lịch sử phát triển ........................................................................................... 9

4. Các steviol glycoside trong cỏ ngọt............................................................. 10

III. NHỮNG NGHIÊN CỨU TRƢỚC ĐÂY....................................................... 14

1. Phƣơng pháp chiết xuất ............................................................................... 14

2. Phƣơng pháp cô lập và tinh chế................................................................... 16

3. Phƣơng pháp kiểm tra độ tinh khiết............................................................. 18

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 20

I. ĐỐI TƢỢNG THÍ NGHIỆM ........................................................................... 20

II. DỤNG CỤ, THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT........................................................ 20

1. Dụng cụ ....................................................................................................... 20

2.Thiết bị phân tích ......................................................................................... 21

3. Hóa chất ....................................................................................................... 21

III. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................................................................. 23

1. Khảo sát hệ dung môi và phƣơng pháp ly trích .......................................... 23

2. Quy trình chiết chung ................................................................................. 23