Nghiên cứu quy trình phát hiện Streptococcus Agalactiae bằng kỹ thuật Real-time PCR trên phụ nữ thai sản

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

--------∞0∞--------

NGUYỄN THỊ THANH THẢO

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH PHÁT HIỆN

STREPTOCOCCUS AGALACTIAE BẰNG KỸ THUẬT

REAL-TIME PCR TRÊN PHỤ NỮ THAI SẢN

LUẬN VĂN THẠC SĨ

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TP. HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

--------∞0∞--------

NGUYỄN THỊ THANH THẢO

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH PHÁT HIỆN

STREPTOCOCCUS AGALACTIAE BẰNG KỸ THUẬT

REAL-TIME PCR TRÊN PHỤ NỮ THAI SẢN

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số chuyên ngành: 8 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS. LƯƠNG THỊ MỸ NGÂN

TP. HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA C NG NGH INH HỌC

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨAVI T NAM

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

GIẤY XÁC NHẬN

Tôi tên là : u n T T n T

à sin : 27/11/1987 ơi sin : u n i

C u ên n àn : Côn n sin M viên : 1884202010005

Tôi đồn ý un ấp t àn văn t ôn tin k ó luận tốt nghi p hợp l về b n quyền cho

T ư vi n trườn đại h c Mở T àn p ố Hồ C í Min . T ư vi n trườn đại h c Mở

T àn p ố Hồ C í Min sẽ kết nối t àn văn t ôn tin k ó luận tốt nghi p và thống

t ôn tin k c của Sở Khoa h và Côn n T àn p ố Hồ C í Min .

Ký tên

(Ghi rõ họ và tên)

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan rằng luận văn “Nghiên cứu quy trình phát hiện Streptococcus

agalactiae bằng kỹ thuật real-time PCR trên phụ nữ thai sản” là bài nghiên cứu của

chính tôi.

Ngoại trừ những tài liệu tham khảo được trích dẫn trong luận văn này, tôi cam đoan

rằng toàn phần hay những phần nhỏ của luận văn này chưa từng được công bố hoặc được

sử dụng để nhận bằng cấp ở những nơi khác.

Không có sản phẩm/nghiên cứu nào của người khác được sử dụng trong luận văn

này mà không được trích dẫn theo đúng quy định.

Luận văn này chưa bao giờ được nộp để nhận bất kỳ bằng cấp nào tại các trường

đại học hoặc cơ sở đào tạo khác.

TP. Hồ Chí Minh, năm 2021

Nguyễn Thị Thanh Thảo

ii

LỜI CẢM ƠN

Trong cuộc sống khó có sự thành công nào mà không gắn liền với sự động viên,

hỗ trợ, giúp đỡ dù nhiều hay ít, dù gián tiếp hay trực tiếp của mọi người xung quanh.

Suốt thời gian học tập tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của quý thầy cô,

gia đình và bạn bè. Tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc nhất đến quý thầy cô ở Khoa Sau đại

học - ngành Công nghệ sinh học, trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh đã giảng

dạy, truyền đạt kiến thức cơ bản, nền tảng và nâng cao giúp tôi làm cơ sở hoàn thành

cho đề tài “NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH PHÁT HIỆN STREPTOCOCCUS

AGALACTIAE BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR TRÊN PHỤ NỮ THAI SẢN”.

Trước hết, lời đầu tiên tôi xin gửi tới Cô TS. Lương Thị Mỹ Ngân. Người đã trực

tiếp chỉ dẫn, động viên, góp ý, củng cố kiến thức và chia sẻ kinh nghiệm quý báu giúp

tôi hoàn thành luận văn lời biết ơn chân thành nhất.

Bên cạnh đó, tôi gửi lời cảm ơn sâu sắc đến em Nguyễn Thị Trúc Phương và tất

cả thành viên tại Phòng R&D công ty TBR (59 đường số 26, phường Bình Trị Đông B,

quận Bình Tân, TP.HCM) đã tạo điều kiện tốt nhất, thuận lợi nhất về các trang thiết bị

và phương pháp thực hiện để tôi hoàn thành đề tài.

Song song đó, tôi chân thành cảm ơn đến Trung tâm xét nghiệm chẩn đoán Y khoa

Hanhphuclab đã nhiệt tình hỗ trợ nguồn mẫu thực tế.

Và sau cùng, lời cảm ơn sâu sắc xin gửi đến gia đình tôi, đã luôn bên cạnh, động

viên, cổ vũ tinh thần tôi trong suốt quá trình học và làm đề tài.

Với tất cả sự chân thành và sâu sắc nhất, tôi xin chúc cho tất cả mọi người luôn

tràn đầy sức khỏe, hạnh phúc và thành công trong cuộc sống.

Ngoài ra, điều kiện thời gian cũng như kinh nghiệm vẫn còn hạn chế của tôi, luận

văn này khó tránh khỏi thiếu sót. Tôi kính mong nhận được sự chỉ dạy, đóng góp ý kiến

của quý Thầy Cô để tôi bổ sung, cải thiện và nâng cao kiến thức của mình.

Xin chân thành cảm ơn.

iii

TÓM TẮT

Nhiễm trùng huyết sơ sinh (NTHSS) là nguyên nhân phổ biến thứ ba gây tử vong

ở trẻ sơ sinh với tỷ lệ 11 – 19% và ảnh hưởng đến khoảng 3 triệu trẻ em trên toàn thế

giới (Kim et al., 2020, Molloy et al., 2020). Bệnh có thể dẫn đến nhiều triệu chứng nguy

hiểm như viêm phổi, nhiễm trùng huyết, viêm màng não nên trẻ dễ tử vong hoặc mang

các di chứng suốt đời như thần kinh kém phát triển, suy giảm vận động (Shah et al.,

2008, Stoll et al., 2004). Vi khuẩn Streptococcus agalactiae – liên cầu khuẩn nhóm B

(GBS – Group B Streptococcus) được xác định là một trong những tác nhân truyền

nhiễm hàng đầu gây ra NTHSS giai đoạn sớm. Việc tầm soát GBS và tiêm kháng sinh

dự phòng ở những phụ nữ mang thai có thể giúp giảm tỷ lệ NTHSS hữu hiệu.

Phương pháp truyền thống dùng để phát hiện GBS đang được sử dụng hiện nay là

nuôi cấy trên đĩa thạch máu. Phương pháp này cần môi trường chọn lọc phức tạp, rất tốn

thời gian (36 – 72 h), công sức và độ nhạy thấp. Do đó, nghiên cứu này được thực hiện

nhằm tối ưu hóa phản ứng real-time PCR, với cặp mồi và mẫu dò được thiết kế nhằm

phát hiện gen đặc hiệu cfb của GBS, có thể phát hiện GBS nhanh và chính xác hơn

phương pháp truyền thống. Các thí nghiệm tối ưu hóa được thực hiện trên chủng GBS

ATCC 13813. Độ đặc hiệu của quy trình tối ưu được kiểm tra trên DNA của chủng

Staphylococcus aureus ATCC 25923, Gardnerella vaginalis và Chlamydia trachomatis.

Ngoài ra, quy trình tối ưu được thử nghiệm trên 30 mẫu dịch phết âm đạo-trực tràng của

phụ nữ mang thai trong giai đoạn 35-37 tuần.

Kết quả, quy trình real-time PCR tối ưu đặc hiệu với chủng GBS, có độ nhạy 50

bản sao/phản ứng, độ chính xác 99,94%, và hiệu quả khuếch đại EA% = 94,5%. Trong

số 30 mẫu thử nghiệm, 10 mẫu (tỷ lệ 33,3%) được phát hiện là có hiện diện của GBS

bằng real-time PCR, trong khi nuôi cấy truyền thống chỉ phát hiện 8 mẫu (tỷ lệ 26,7%)

có GBS. Như vậy, quy trình real-time PCR nhận diện GBS đã tối ưu cho kết quả nhận

diện tốt hơn và thời gian nhanh hơn so với phương pháp nuôi cấy truyền thống. Tuy

iv

nhiên, cần tiến hành thử nghiệm trên số lượng mẫu lớn hơn để ghi nhận số liệu chính

xác về khả năng nhận diện GBS bằng real-time PCR. Từ đó đưa kiến nghị sử dụng real￾time PCR trong tầm soát GBS trên phụ nữ mang thai như một xét nghiệm thường quy.

v

SUMMARY

Neonatal sepsis (NS) is the third most common cause of infant mortality at 11 -

19% and affects approximately 3 million children worldwide. NS can lead to many

dangerous symptoms such as pneumonia, sepsis, meningitis, so children can die easily

or carry lifelong sequelae such as neurodevelopmental impairment, impaired mobility

due to of neonatal sepsis. Streptococcus agalactiae – Group B Streptococcus bacteria

(GBS) is the major contagious cause of early onset sepsis in newborns. Screening and

intrapartrum antibiotic prophylaxis for GBS in pregnant women could effectively reduce

the rate of NS.

Conventional method for GBS identification currently is culturing on the blood

plate medium. This method requires the complex selection medium, time consuming (36

– 72 h), labor intensive, and low sensitivity. Therefore, this study is aimed to optimize

parameters for a real-time PCR reaction, with primers and a probe designed to detect

GBS-specific cfb gene, able to detect GBS faster and more accurately than culture

method. The optimized experiments were carried out on the strain S. agalactiae ATCC

13813. The specificity of the optimized procedure was tested on DNA samples of

Staphylococcus aureus ATCC 25923, Gardnerella vaginalis and Chlamydia

trachomatis. In addition, the optimized reaction was tested on 30 vaginal-rectal samples

from pregnant women between 35 – 37 weeks gestation.

As a result, the optimized procedure was specific to GBS with the sensitivity of 50

copies/reaction, the accuracy of 99.94%, and amplification efficiency (EA%) of 94.5%.

GBS was detected in ten samples among the 30 vaginal-rectal samples (rate 33.3%) by

the real-time PCR, while only eight samples (rate 26.7%) were found to be positive in

the conventional plate method. This indicates that the optimized procedure of real-time

PCR for GBS identification is more sensitive and faster than the conventional culture

vi

method. In order to be applied in diagnostic practice, the procedure needs to be tested

with a larger sample size.

vii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................................i

LỜI CẢM ƠN................................................................................................................ ii

TÓM TẮT..................................................................................................................... iii

SUMMARY ....................................................................................................................v

DANH MỤC HÌNH........................................................................................................x

DANH MỤC BẢNG......................................................................................................xi

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT...................................................................................... xii

Chương 1. GIỚI THIỆU................................................................................................1

1.1. Cơ sở hình thành luận văn..................................................................................2

1.2. Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................................3

1.3. Câu hỏi nghiên cứu..............................................................................................3

1.4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ......................................................................3

1.5. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................4

1.6. Ý nghĩa nghiên cứu..............................................................................................4

Chương 2. CƠ SỞ TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU......................................................5

2.1. Tổng quan về nhiễm trùng huyết sơ sinh ..........................................................6

2.1.1. Định nghĩa bệnh nhiễm trùng huyết sơ sinh....................................................6

2.1.2. Các giai đoạn của nhiễm trùng sơ sinh............................................................6

2.1.3. Biểu hiện lâm sàng của nhiễm trùng sơ sinh...................................................7

2.1.4. Chẩn đoán nhiễm trùng sơ sinh ......................................................................8

2.1.5. Điều trị nhiễm trùng sơ sinh..........................................................................10

2.2. Tổng quan về vi khuẩn GBS.............................................................................11

2.2.1. Đặc điểm sinh học .........................................................................................11

2.2.2. Các bệnh gây ra bởi GBS..............................................................................14

2.2.3. Phòng ngừa và điều trị các bệnh do GBS......................................................17

2.3. Phương pháp lấy mẫu lâm sàng để sàng lọc GBS ở phụ nữ thai sản ...........17