Nghiên cứu hoạt tính sinh học và thành phần hóa học của một số loài thuộc chi Ficus ở Việt Nam

viÖn hµn l©m khoa häc vµ c«ng nghÖ viÖt nam

ViÖn c«ng nghÖ sinh häc

NGUYÔN XU¢N C¦êNG

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC VÀ

THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA MỘT SỐ LOÀI

THUỘC CHI FICUS Ở VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC

Hµ néi - 2014

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGUYỄN XUÂN CƯỜNG

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC VÀ THÀNH

PHẦN HÓA HỌC CỦA MỘT SỐ LOÀI THUỘC

CHI FICUS Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành: Hóa sinh học

Mã số: 62 42 01 16

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: 1. GS.TS. Trương Nam Hải

Viện Công nghệ sinh học

2. PGS.TS. Phan Văn Kiệm

Viện Hóa sinh biển

Hà Nội, 2014

-i￾LỜI CẢM ƠN



Luận án này được thực hiện tại Phòng Nghiên cứu cấu trúc, Viện Hóa

sinh Biển và Phòng Kỹ thuật Di truyền, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn

lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, với sự hỗ trợ kinh phí của đề tài

nghiên cứu cơ bản được tài trợ bởi Quỹ phát triển Khoa học và Công nghệ

Quốc gia - NAFOSTED (mã số: 104.01.31.09).

Tôi xin trân trọng cảm ơn GS TS. Trương Nam Hải, Viện Công nghệ

sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, PGS TS. Phan

Văn Kiệm, GS TS. Châu Văn Minh, Viện Hoá sinh biển và GS TS. Kim

Young Ho, Đại học Dược, Đại học Quốc gia Chungnam, Hàn Quốc đã tận

tình hướng dẫn, chỉ bảo trong quá trình thực hiện Luận án. Đồng thời tôi xin

trân trọng cảm ơn PGS TS. Ninh Khắc Bản, Phòng Tài nguyên Sinh vật,

Viện Hóa sinh biển đã giúp giám định loài các mẫu thực vật.

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Hóa sinh biển và

Viện Công nghệ sinh học, các cán bộ Phòng Nghiên cứu cấu trúc, Phòng

Dược liệu biển, Viện Hoá sinh biển, và Phòng Kỹ thuật Di truyền, Viện Công

nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều

kiện thuận lợi và tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án.

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đối với những người thân trong

gia đình, đồng nghiệp và bạn bè đã luôn ủng hộ, động viên tôi trong suốt

thời gian qua để tôi có thể hoàn thành tốt công việc nghiên cứu của mình.

Hà Nội, ngày tháng năm 2014

Nguyễn Xuân Cường

-ii￾LỜI CAM ĐOAN



Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với

các cộng sự khác.

Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã

được công bố trên tạp chí khoa học chuyên ngành quốc tế và quốc gia và đã

được sự đồng ý của các đồng tác giả.

Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất cứ công trình nào khác.

Hà Nội, ngày tháng năm 2014

Tác giả

Nguyễn Xuân Cường

-iii￾MỤC LỤC



Trang

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 3

1.1. SƠ LƯỢC VỀ CHI SUNG (FICUS L.) 3

1.2. CÁC NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC CHI SUNG (FICUS L.) 5

1.2.1. Các nghiên cứu trên thế giới 5

1.2.2. Các nghiên cứu trong nước 9

1.3. CÂY GỪA F. MICROCARPA 10

1.3.1. Mô tả, phân bố và sinh thái

1.3.2. Công dụng và hoạt tính sinh học

1.3.3. Thành phần các hợp chất trao đổi thứ cấp đã được nghiên cứu

10

11

15

1.4. CÂY ĐA BÚP ĐỎ F. ELASTICA 25

1.4.1. Mô tả, phân bố và sinh thái

1.4.2. Công dụng, hoạt tính sinh học và thành phần hóa học

25

25

1.5. CÂY ĐA LÔNG F. DRUPACEA 26

1.5.1. Mô tả, phân bố và sinh thái

1.5.2. Công dụng, hoạt tính sinh học và thành phần hóa học

26

26

1.6. CÂY GÀO F. CALLOSA 26

1.7. SỰ ÔXI HÓA VÀ GỐC TỰ DO 27

1.7.1. Bản chất quá trình ôxi hóa

1.7.2. Hệ thống các chất chống ôxi hóa của cơ thể

27

34

1.8. BỆNH TIỂU ĐƯỜNG VÀ HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYM α-GLUCOSIDASE

1.8.1. Bệnh tiểu đường

1.8.2. Hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase

38

38

40

1.9. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHỔ CỘNG HƯỞNG TỪ HẠT NHÂN TRONG

XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA CÁC HỢP CHẤT TRAO ĐỔI THỨ

CẤP

43

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

46

46

-iv￾2.1.1. Cây Gừa Ficus microcarpa

2.1.2. Cây Đa búp đỏ Ficus elastica

2.1.3. Cây Gào Ficus callosa

2.1.4. Cây Đa lông Ficus drupacea

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

46

46

47

47

47

2.2.1. Phương pháp chiết xuất các hợp chất trao đổi thứ cấp

2.2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất trao đổi thứ cấp

2.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất trao đổi thứ cấp

2.2.4. Phương pháp đánh giá hoạt tính chống ôxy hóa

2.2.5. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng enzym α-glucosidase

47

48

58

59

61

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. KẾT QUẢ THU THẬP CÁC LOÀI FICUS

62

62

3.2. KẾT QUẢ PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT TRAO ĐỔI THỨ CẤP 64

3.2.1. Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất trao đổi thứ cấp từ cây

Gừa F. microcarpa

3.2.2. Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất trao đổi thứ cấp từ cây Đa

búp đỏ F. elastica

3.2.3. Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất trao đổi thứ cấp từ cây

Gào F. callosa

3.2.4. Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất trao đổi thứ cấp từ cây Đa

lông F. drupacea

64

69

74

79

3.3. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH CHỐNG ÔXI HÓA 84

3.3.2. Kết quả đánh giá hoạt tính chống ôxi hóa của các chất trao đổi thứ cấp từ

cây Gừa F. microcarpa

3.3.2. Kết quả đánh giá hoạt tính chống ôxi hóa của các chất trao đổi thứ cấp từ

cây Đa búp đỏ F. elastica

3.3.3. Kết quả đánh giá hoạt tính chống ôxi hóa của các chất trao đổi thứ cấp từ

cây Gào F. callosa

84

85

87

3.4. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG ENZYM α-GLUCOSIDASE 88

CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ

4.1. BÀN LUẬN XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA CÁC HỢP CHẤT

89

89

-v￾TRAO ĐỔI THỨ CẤP

4.1.1. Bàn luận xác định cấu trúc hóa học các hợp chất trao đổi thứ cấp phân lập

được từ cây Gừa F. microcarpa

4.1.2. Bàn luận xác định cấu trúc hóa học các hợp chất trao đổi thứ cấp phân lập

được từ cây Đa búp đỏ F. elastica

4.1.3. Bàn luận xác định cấu trúc hóa học các hợp chất trao đổi thứ cấp phân lập

được từ cây Gào F. callosa

4.1.4. Bàn luận xác định cấu trúc hóa học các hợp chất trao đổi thứ cấp phân lập

được từ cây Đa lông F. drupacea

89

96

102

105

4.2. BÀN LUẬN KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC 110

4.2.1. Bàn luận kết quả đánh giá hoạt tính chống ôxi hóa

4.2.2. Bàn luận kết quả đánh giá hoạt tính kháng enzym α-glucosidase

110

114

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

DANH MỤC CÁC CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI

LUẬN ÁN

TÓM TẮT KẾT QUẢ THỰC HIỆN LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

117

119

121

125

143

-vi￾NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

13C NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13

Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

1H NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

Proton Magnetic Resonance Spectroscopy

COSY 1H￾1H Chemical Shift Correlation Spectroscopy

2D-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều

Two-Dimensional NMR

CC Sắc ký cột

Column Chromatography

DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

HMBC Heteronuclear Multiple Bond Connectivity

HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence

IR Phổ hồng ngoại

Infrared Spectroscopy

Me Nhóm methyl

MS Phổ khối lượng

Mass Spectroscopy

NOESY Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy

ORAC Oxygen radical absorbance capacity

TLC Sắc ký lớp mỏng

Thin Layer Chromatography

mp. Melting point

Điểm chảy

-vii￾DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của các hợp chất 1 - 17 16

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của các hợp chất 18 - 40 17

Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của các hợp chất 41 - 54 18

Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của các hợp chất 55 - 65 20

Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của các hợp chất 66 - 76 21

Hình 1.6. Cấu trúc hóa học của các hợp chất 77 - 87 22

Hình 1.7. Cấu trúc hóa học của các hợp chất 88 -98 23

Hình 1.8. Cấu trúc hóa học của các hợp chất 99 -112 24

Hình 1.9. Dạng hoạt động của nitơ và ôxi tham gia vào hiện tượng

stress ôxi hóa

32

Hình 1.10. Những trạng thái bệnh lý chính liên quan mật thiết đến gốc

tự do

33

Hình 2.1. Cây Gừa F. microcarpa 46

Hình 2.2. Cây Đa búp đỏ - F. elastica 46

Hình 2.3. Cây Gào - F. callosa 47

Hình 2.4. Cây Đa lông - F. drupacea 47

Hình 2.5. Sơ đồ chiết phân đoạn mẫu cây Gào - F. Callosa

và phân lập các hợp chất từ cặn chiết CHCl3 và EtOAc

49

Hình 2.6. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ lớp nước 50

Hình 2.7. Sơ đồ chiết phân đoạn mẫu cây Đa lông - F. drupacea và

phân lập các hợp chất từ cặn chiết n-hexane

52

Hình 2.8. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ lớp nước 53

-viii￾Hình 2.9. Sơ đồ chiết phân đoạn và phân lập các chất từ cây Đa búp

đỏ - F. elastica

54

Hình 2.10. Sơ đồ chiết phân đoạn mẫu cây Gừa - F. microcarpa và

phân lập các hợp chất từ cặn chiết CHCl3 và EtOAc

56

Hình 2.11. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ lớp nước 57

Hình 4.1. Phổ 1H-NMR của hợp chất FM1 89

Hình 4.2. Cấu trúc hóa học của hợp chất FM1 90

Hình 4.3. Phổ 13C-NMR của hợp chất FM1 91

Hình 4.4. Phổ HMQC của hợp chất FM1 91

Hình 4.5. Phổ HMBC của hợp chất FM1 91

Hình 4.6. Các tương tác HMBC chính của hợp chất FM1 92

Hình 4.7. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất FM1 92

Hình 4.8. Cấu trúc hóa học của hợp chất FM8 93

Hình 4.9. Các tương tác HMBC chính của hợp chất FM8 95

Hình 4.10. Tổng hợp các chất trao đổi thứ cấp phân lập được từ cây F.

microcarpa

96

Hình 4.11. Cấu trúc hóa học của hợp chất FE2 97

Hình 4.12. Các tương tác ROESY chính của hợp chất FE2 98

Hình 4.13. Cấu trúc hóa học của hợp chất FE7 100

Hình 4.14. Các tương tác ROESY chính của hợp chất FE7 100

Hình 4.15. Tổng hợp các chất trao đổi thứ cấp phân lập được từ cây F.

elastica

101

Hình 4.16. Cấu trúc hóa học của hợp chất FC1 102

-ix￾Hình 4.17. Các tương tác HMBC chính của hợp chất FC1 104

Hình 4.18. Tổng hợp các chất trao đổi thứ cấp phân lập được từ cây F.

callosa

105

Hình 4.19. Cấu trúc hóa học của hợp chất FD1 106

Hình 4.20. Các tương tác ROESY chính của hợp chất FD1 107

Hình 4.21. Cấu trúc hóa học của hợp chất FD3 107

Hình 4.22. Các tương tác HMBC chính của hợp chất FD3 108

Hình 4.23. Tổng hợp các chất trao đổi thứ cấp phân lập được từ cây F.

drupacea

109

Hình 4.24. Hoạt tính chống ôxi hóa của các hợp chất phân lập được từ

lá cây Gào F. callosa ở nồng độ 1 và 2 M

111

Hình 4.25. Hoạt tính chống ôxi hóa của các hợp chất phân lập được từ

cây Đa búp đỏ F. elastica ở nồng độ 1 và 5 M

112

Hình 4.26. Hoạt tính chống ôxi hóa của các hợp chất phân lập được từ

lá cây Gừa F. microcarpa ở nồng độ 1 và 2 M

113

Hình 4.27. Mức độ ức chế enzym α-glucosidase của các hợp chất phân

lập được từ cây Đa lông F. drupacea ở nồng độ 100 μM

115

-x￾DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1. Hoạt tính chống oxy hóa của các dịch chiết cây Gừa cùng với

một số hợp chất và hàm lượng tổng các hợp chất phenol

trong các cặn chiết

11

Bảng 1.2. Hoạt tính kháng khuẩn của các dịch chiết cây Gừa và

ampicillin

13

Bảng 1.3. Hoạt tính chống oxy hóa của các dịch chiết rễ khí sinh cây

Gừa cùng với một số hợp chất và hàm lượng tổng các hợp

chất phenol trong các cặn chiết

13

Bảng 1.4. Hoạt tính kháng khuẩn của các dịch chiết của rễ khí sinh cây

Gừa và ampicillin

14

Bảng 1.5. Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất 58-65 19

Bảng 3.1. Danh sách các loài Ficus thu thập được 62

Bảng 3.2. Kết quả hoạt tính thu dọn gốc tự do ROO

của các hợp chất

FM1-FM14

84

Bảng 3.3. Kết quả đánh giá khả năng khử ion đồng Cu2+ của các hợp

chất FM1-FM14

85

Bảng 3.4. Kết quả hoạt tính thu dọn gốc tự do ROO

của các hợp chất

FE1-FE14

85

Bảng 3.5. Kết quả đánh giá khả năng khử ion đồng Cu2+ của các hợp

chất FE1-FE14

86

Bảng 3.6. Kết quả hoạt tính thu dọn gốc tự do ROO

của các hợp chất

FC1-FC12

87

-xi￾Bảng 3.7. Kết quả đánh giá khả năng khử ion đồng Cu2+ của các hợp

chất FC1-FC12

87

Bảng 3.8. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng enzym α-glucosidase của

các hợp chất FD1 – FD10 phân lập được từ cây Đa lông F.

drupacea ở nồng độ 100 μM

88

Bảng 4.1. Số liệu phổ NMR của hợp chất FM1 90

Bảng 4.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất FM8 94

Bảng 4.3. Số liệu phổ NMR của hợp chất FE2 97

Bảng 4.4. Số liệu phổ NMR của hợp chất FE7 99

Bảng 4.5. Số liệu phổ NMR của hợp chất FC1 103

Bảng 4.6. Số liệu phổ NMR của hợp chất FD1 106

Bảng 4.7. Số liệu phổ NMR của hợp chất FD3 108

-1-

MỞ ĐẦU

Lãnh thổ Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa. Có tới 3/4

diện tích của cả nước là rừng núi trùng điệp, địa hình chia cắt nên điều kiện khí hậu

cũng rất đa dạng, có nhiều tiểu vùng khí hậu khá đặc trưng. Đất đai của cả nước đều

thể hiện tính chất nhiệt đới ẩm điển hình, rất phức tạp, rất đa dạng về loại hình, về

phân bố và về chất lượng. Những yếu tố đó tạo nên những điều kiện sinh thái,

những thảm thực vật nhiệt đới rậm, ẩm, thường xanh, hoặc thưa, nửa rụng lá và cả

các thảm thực vật mang tính cận nhiệt đới ở các khu vực núi cao... Theo ước tính,

Việt Nam có khoảng gần 13000 loài thực vật bậc cao có mạch trong đó có khoảng

hơn 4000 loài được sử dụng làm thuốc. Đa số các loài thực vật đó đều sống hoang

dại. Một số cây thuốc quý được nhập trồng phổ biến ở nhiều địa phương như bạc

hà, bạch chỉ, bạch truật, đương quy, huyền sâm, ngưu tất, vân mộc hương, xuyên

khung... cũng trở nên quen thuộc.

Ngoài sự phong phú về thành phần chủng loại, nguồn dược liệu Việt Nam

còn có giá trị to lớn ở chỗ chúng được sử dụng rộng rãi trong cộng đồng để chữa

nhiều chứng bệnh khác nhau. Các cây thuốc được sử dụng dưới hình thức độc vị

hay phối hợp với nhau tạo nên các bài thuốc cổ phương, còn tồn tại và thịnh hành

đến ngày nay. Ngoài ra, hàng trăm cây thuốc đã được khoa học y - dược hiện đại

chứng minh về giá trị chữa bệnh của chúng. Nhiều loại thuốc được chiết xuất từ

dược liệu Việt Nam như rutin, D-strophantin, berberin, palmatin, L￾tetrahydropalmatin, artermisinin, các sản phẩm từ tinh dầu đã được sử dụng rộng rãi

trong nước và xuất khẩu. Xu hướng đi sâu nghiên cứu xác minh Y học cổ truyền và

tìm kiếm các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao để làm thuốc từ dược liệu

ngày càng được thế giới quan tâm.

Việc sử dụng các hợp chất thiên nhiên và các sản phẩm có nguồn gốc thiên

nhiên làm dược phẩm chữa bệnh đang ngày càng thu hút được sự quan tâm của các

nhà khoa học cũng như cộng đồng bởi ưu điểm của chúng là độc tính thấp, dễ hấp

thu và chuyển hóa trong cơ thể hơn so với các dược phẩm tổng hợp.

-2-

Mặc dù Ficus là một chi lớn, được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm

nghiên cứu và thể hiện nhiều hoạt tính sinh học quý báu, nhưng ở nước ta, vẫn chưa

có nhiều nghiên cứu mang tính hệ thống để tạo ra cơ sở khoa học phục vụ lâu dài.

Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi đã thực hiện đề tài "Nghiên cứu hoạt tính sinh

học và thành phần hóa học một số loài thuộc chi Ficus ở Việt Nam", với mục

tiêu và nội dung nghiên cứu sau:

Mục tiêu nghiên cứu:

1. Nghiên cứu được thành phần các hợp chất trao đổi thứ cấp theo định hướng

hoạt tính sinh học của một số loài thuộc chi Sung (Ficus L.).

3. Đánh giá được hoạt tính sinh học (secondary bioassay) của các hợp chất đã

phân lập được nhằm tìm kiếm các dược chất có triển vọng.

Nội dung nghiên cứu:

1. Thu thập mẫu lượng lớn 04 loài Ficus là: F. callosa, F. elastica, F. drupacea và

F. microcarpa để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.

2. Nghiên cứu phân lập các hợp chất trao đổi thứ cấp theo định hướng hoạt tính

sinh học của các loài F. callosa, F. elastica, F. drupacea và F. microcarpa sử

dụng các phương pháp sắc ký.

3. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được bằng các phương

pháp phổ

4. Đánh giá hoạt tính chống ôxi hóa (phương pháp ORAC) và hoạt tính ức chế

enzym α-glucosidase của các hợp chất.