Nghiên cứu hoạt tính sinh học một số hợp chất ngoại bào của xạ khuẩn phân lập từ vùng biển Đông Bắc bộ và miền Trung Việt Nam

1

MỞ ĐẦU

Việt Nam là quốc gia ven biển nằm bên bờ Tây của Biển Đông, có địa chính trị và

địa kinh tế rất quan trọng không phải bất kỳ quốc gia nào cũng có. Với bờ biển dài trên

3.260 km trải dài từ Bắc xuống Nam, đứng thứ 27 trong số 157 quốc gia ven biển, các

quốc đảo và các lãnh thổ trên thế giới. Chỉ số chiều dài bờ biển trên diện tích đất liền của

nước ta là xấp xỉ 0,01 (nghĩa là cứ 100 km2

đất liền có 1km bờ biển). Trong 63 tỉnh, thành

phố của cả nước thì 28 tỉnh, thành phố có biển và gần một nửa dân số sinh sống tại các

tỉnh, thành ven biển. Các nghiên cứu trước đây đã cho thấy, vùng biển nước ta là một

trong số các vùng biển có hệ đa dạng sinh học phong phú nhất. Đồng thời, VSV biển có sự

phân bố rất dồi dào và đa dạng, tuy nhiên cho tới nay, ở nước ta chưa có nhiều công trình

nghiên cứu các hợp chất thứ cấp được sinh tổng hợp từ các VSV biển.

Ngược lại, việc nghiên cứu các hoạt chất thứ cấp có hoạt tính sinh học được sản

sinh từ VSV biển trên thế giới đã thu được nhiều thành tựu đáng kể, nhiều hợp chất thứ

cấp với cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học lý thú đã được phát hiện. Đồng thời nhiều

hợp chất trong số này đã và đang được thử nghiệm sâu hơn nhằm ứng dụng trong y dược.

Nhiều loại kháng sinh được chiết xuất từ nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn, mà xạ khuẩn chiếm

phần lớn trong đó có các xạ khuẩn biển. Do đại dương chiếm 70% diện tích bề mặt trái

đất, là nơi có sự đa dạng về sinh học lớn nhất trên trái đất. Vì môi trường biển đã được biết

đến như một nguồn phong phú cung cấp các hợp chất thiên nhiên, như một kho dược liệu

khổng lồ đang chờ được khai thác và khám phá. Đặc thù môi trường sống khắc nghiệt

dưới biển sâu chính là điều kiện để hình thành các hợp chất hữu cơ với những đặc điểm

cấu trúc hóa học độc đáo và hoạt tính sinh học quý giá.

Hơn nữa, ngày càng nhiều các VSV gây bệnh trong đó có vi khuẩn lao kháng

với các kháng sinh hiện có và các bệnh ung thư. Do đó, công cuộc tìm kiếm các loại

thuốc mới chống lao, ung thư cũng như các bệnh truyền nhi m khác v n đang là vấn đề

mang tính cấp bách trên toàn cầu.

Vì vậy chúng tôi thực hiện luận án này với mục đích: “Nghiên cứu hoạt tính sinh

học một số hợp chất ngoại bào của xạ khuẩn phân lập từ vùng biển Đông Bắc bộ và

miền Trung Việt Nam”.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án:

- Nghiên cứu hoạt tính sinh học một số hợp chất ngoại bào của xạ khuẩn phân

lập từ vùng biển Đông Bắc bộ và miền Trung Việt Nam.

- Tìm kiếm các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học cao từ nguồn xạ khuẩn biển thông

qua đánh giá sàng lọc hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định, kháng lao và gây độc tế bào.

Những đóng góp mới của luận án

- Từ 140 m u vật thu thập được từ 1 số vùng biển Việt Nam, 130 chủng vi sinh

vật đã được phân lập.

- Sàng lọc hoạt tính kháng VSVKĐ (6 chủng vi khuẩn và 1 chủng nấm) và kháng lao

(H37Rv) của cặn chiết các chủng xạ khuẩn phân lập được cho thấy 105/ 130 chủng thể hiện

hoạt tính kháng ít nhất 1 chủng VSVKĐ, 3 chủng thể hiện hoạt tính kháng lao.

- Đã lựa chọn và xác định được tên khoa học của mười chủng có hoạt tính cao

bằng giải trình tự gen 16S rRNA. Trong đó các chủng G017, G019, G043, G044, G047,

G068, G120 thuộc chi Micromonospora, các chủng G039, G065 thuộc chi Stretomyces,

chủng G057 thuộc chi Nocardiopsis.

- Dịch lên men của 5 chủng có hoạt tính cao đã được nghiên cứu thành phần

hóa học bằng các phương pháp sắc ký. Đã xác định được 44 hợp chất.

2

Trong số 44 hợp chất được tách chiết và xác định cấu trúc hóa học, đã xác

định được 3 hợp chất mới là 3,4-dihydroxy-6,7-dimethyl-quinoline-2-carboxylic

(G019-1), 2-[(5-methyl-1,4-dioxan-2-yl)methoxy]ethanol (G019-2), 2-[(2R￾hydroxypropanoyl)amino]benzamide (G057-1), và 2 chất mới lần đầu tiên được

tách chiết từ tự nhiên là 3,3’-bis-indole (G057-2), 3-acetyl-4-hydroxycinnoline (G057-

3) và 1 hoạt chất là bis(2-ethylhexyl) adipate (G043-12) có hoạt tính kháng lao.

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN

Phần tổng quan tại liệu tổng hợp các nghiên cứu trong nước và ngoài nước đề

cập đến các vấn đề chính sau:

1.1. Đa dạng vi sinh vật biển

1.2. Sự hình thành chất kháng sinh ở xạ khuẩn

1.3. Xạ khuẩn biển

1.3.1. Họ Streptomycetaceae:

1.3.2. Họ Micromonosporaceae:

1.3.3. Các họ khác của xạ khuẩn biển

1.4. Hoạt hính sinh học của xạ khuẩn biển

1.4.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Hoạt tính kháng lao

Hoạt tính kháng sinh

Hoạt tính chống ung thư

1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước

CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu nghiên cứu

2.1.1. Vật liệu

- Tổng số m u thu thập được là 140 m u, trong đó có: 76 m u ở Vịnh Bái Tử

Long, 29 m u ở Đảo Cô Tô – Thanh Lân , 9 m u trầm tích ở Hạ Long - Cát Bà, 10 m u

Hải miên Hải Vân – Sơn Chà và 16 m u Vịnh Vân Phong – Khánh Hòa và được lưu giữ

tiêu bản tại Viện Hóa sinh biển, Viện Tài nguyên và môi trường biển Hải Phòng do PGS.TS

Đỗ Công Thung định tên.

- Cặp mồi dùng để khuếch đại gen 16s rARN của xạ khuẩn.

- Các chủng vi sinh vật kiểm định chuẩn quốc tế: 3 chủng vi khuẩn Gram –

(Escherichia coli ATCC25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC27853, S. enterica

ATCC12228), 3 chủng Gram + (E. faecalis ATCC13124, Stapphylococus aureus ATCC25923,

Bacillus cereus ATCC 13245), 1 chủng Nấm men Candida albicans ATCC10231 được cung

cấp bởi viện Kiểm nghiệm vệ sinh an toàn thực phẩm quốc gia.

- Các dòng tế bào ung thư ở người được cung cấp bởi ATCC gồm: KB - ung thư

biểu mô (CCL – 17TM); Hep G2 - ung thư gan (HB – 8065TM); MCF-7 - ung thư vú (HTB

– 22TM) và LU-1 - ung thư phổi (HTB-57TM) được cung cấp bởi đại học UIC – Hoa Kỳ.

- Chủng vi khuẩn lao H37Rv (ATCC 27294, American Type Culture Colection,

Rockville, MD) được cung cấp bởi đại học UIC – Hoa Kỳ.

2.1.2. Hóa chất: Các hóa chất dùng cho nghiên cứu vi sinh vật biển và tách chiết các

hợp chất thứ cấp được mua của các hãng uy tín của Đức, Ý, Ấn độ.

2.1.3. Thiết bị: Máy móc thiết bị sử dụng trong nghiên cứu vi sinh bao gồm : Máy sốc

nhiệt; máy vortex; máy khuấy từ ; tủ cấy an toàn sinh học Class II; tủ nuôi cấy; máy ly