Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa và kháng khuẩn Escheria Coli của lá gai (Boehmeria Nivea) / Huỳnh Thị Tường Vi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH CHỐNG OXY

HÓA VÀ KHÁNG KHUẨN E. coli CỦA LÁ GAI

(Boehmeria nivea)

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

GVHD: ThS. Tạ Đăng Khoa

SVTH: Huỳnh Thị Tường Vi

MSSV: 1053010939

Khóa: 2010 – 2014

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 2 năm 2013

Nghiên Cứu Khoa Học GVHD: Th.S Tạ Đăng Khoa

SVTH: Huỳnh Thị Tường Vi Trang i

MỤC LỤC

Phần I: GIỚI THIỆU ................................................................................................1

1.1 Đặt vấn đề.............................................................................................................2

1.2 Mục tiêu đề tài......................................................................................................3

Phần II:.......................................................................................................................4

TỔNG QUAN TÀI LIỆU..........................................................................................4

2.1 Cây lá gai (Boehmeria nivea) [9, 11]...................................................................5

2.1.1 Đặc điểm thực vật.........................................................................................6

2.1.2 Thành phần hóa học.....................................................................................9

2.1.3 Công dụng cây lá gai ..................................................................................10

2.2 Quá trình chống oxy hóa [2, 10, 19, 20, 21].....................................................10

2.2.1 Gốc tự do .....................................................................................................10

2.2.2 Cơ chế chống oxy hóa.................................................................................14

2.2.3 Các chất chống oxy hóa..............................................................................15

2.2.4 Các phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết .....22

2.2.4.1 Phương pháp TEAC ............................................................................22

2.2.4.2 Phương pháp DPPH............................................................................22

2.2.4.3 Phương pháp ORAC............................................................................23

2.2.4.4 Phương pháp TRAP.............................................................................23

2.2.4.5 Phương pháp FRAP ............................................................................24

2.3 Phương pháp trích ly.........................................................................................24

2.3.1 Các phương pháp trích ly [3] ....................................................................24

Nghiên Cứu Khoa Học GVHD: Th.S Tạ Đăng Khoa

SVTH: Huỳnh Thị Tường Vi Trang ii

2.3.2 Các dung môi trích ly [1] ...........................................................................25

2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly [1].....................................26

2.4 Quá trình kháng khuẩn [4]...............................................................................27

2.4.1 Tính chất......................................................................................................27

2.4.2 Các phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết................27

2.4.2.1 Phương pháp sử dụng chất nền bán rắn ............................................28

2.4.2.2 Phương pháp sử dụng chất nền lỏng- Broth Dilution Methods (Pha

loãng trong canh trường) ................................................................................31

2.4.2.3 Thin-Layer Chromatography (TLC)–Bioautography (Sắc kí lớp mỏng)

...........................................................................................................................34

2.5 Vi khuẩn .............................................................................................................35

2.5.1 Escherichia coli ...........................................................................................35

2.5.1.1 Giới thiệu..............................................................................................35

2.5.1.2 Đặc điểm và cơ chế gây bệnh ..............................................................37

2.5.2 Pseudomonas aeruginosa [20, 29, 30]........................................................37

2.5.2.1 Giới thiệu [20] ......................................................................................37

2.5.2.2 Đặc điểm và khả năng gây bệnh .........................................................39

2.5.3 Salmonella typhi [21, 24] ............................................................................39

2.5.3.1 Giới thiệu..............................................................................................39

2.5.3.2 Đặc điểm và khả năng gây bệnh [21]..................................................41

2.5.4 Staphylococcus aureus [7] ..........................................................................41

2.5.4.1 Giới thiệu..............................................................................................41

2.5.4.2 Đặc điểm và khả năng gây bệnh .........................................................44

Nghiên Cứu Khoa Học GVHD: Th.S Tạ Đăng Khoa

SVTH: Huỳnh Thị Tường Vi Trang iii

Phần III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..............................46

3.1 Vật liệu nghiên cứu............................................................................................47

3.1.1 Địa điểm thí nghiệm ...................................................................................47

3.1.2 Đối tượng thí nghiệm .................................................................................47

3.1.3 Dụng cụ - thiết bị ........................................................................................47

3.1.4 Hóa chất.......................................................................................................48

3.1.5 Phương pháp phân tích..............................................................................48

3.2 Phương pháp nghiên cứu..................................................................................50

3.2.1 Quy trình sản xuất dự kiến........................................................................50

3.2.2 Thuyết minh quy trình...............................................................................51

3.2.2.1 Xử lý......................................................................................................51

3.2.2.2 Chần......................................................................................................51

3.2.2.3 Xay ........................................................................................................51

3.2.2.4 Trích ly..................................................................................................51

3.2.2.5 Lọc ........................................................................................................51

3.2.2.6 Cô quay .................................................................................................52

3.2.3 Sơ đồ nghiên cứu ........................................................................................53

3.2.4 Bố trí thí nghiệm.........................................................................................54

3.2.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát nguyên liệu ban đầu ....................................54

3.2.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát nồng độ dung môi trích ly............................54

3.2.4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát tỉ lệ nguyên liệu : dung môi.........................57

3.2.4.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát thời gian và nhiệt độ trích ly........................59

3.2.4.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của lá gai.............62

Nghiên Cứu Khoa Học GVHD: Th.S Tạ Đăng Khoa

SVTH: Huỳnh Thị Tường Vi Trang iv

3.2.4.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của lá gai...............63

3.2.4.7 Thí nghiệm 7: Thí nghiệm ứng dụng lá gai vào sản xuất trà túi lọc.64

Phần IV: KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM......................................................................66

4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát nguyên liệu ban đầu .................................................67

4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát nồng độ dung môi trích ly........................................68

4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát tỉ lệ nguyên liệu – dung môi.....................................70

4.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát thời gian và nhiệt độ trích ly ...................................72

4.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của lá gai..........................74

4.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của lá gai............................77

4.7 Thí nghiệm 7: Thí nghiệm ứng dụng lá gai vào sản xuất trà túi lọc.............79

Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................80

5.1 Kết luận ..............................................................................................................83

5.2 Kiến nghị ............................................................................................................84

TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................I

PHỤ LỤC ................................................................................................................III

Nghiên Cứu Khoa Học GVHD: Th.S Tạ Đăng Khoa

SVTH: Huỳnh Thị Tường Vi Trang v

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1: Cây lá gai (Boehmeria nivea)....................................................................5

Hình 2.2: Một số loài thuộc chi gai ...........................................................................6

Hình 2.3: Mặt trước và mặt sau lá loài gai trắng (Boehmeria nivea) .....................7

Hình 2.4: Thân cây lá gai...........................................................................................7

Hình 2.5: Hoa lá gai, hoa cái, hoa đực .....................................................................8

Hình 2.6: Quả lá gai...................................................................................................8

Hình 2.7: Nguyên nhân hình thành gốc tự do........................................................11

Hình 2.8: Cơ chế hình thành gốc tự do...................................................................13

Hình 2.9: Cơ chế hoạt động của chất chống oxy hóa.............................................14

Hình 2.10: Sự gắn kết kim loại của chất chống oxy hóa........................................15

Hình 2.11: Sự phát sinh ROS trong tế bàà hệ thống chống oxy hóa nội sinh trong

quá trình thiếu máu cục bộ - tái tưới máu...............................................................17

Hình 2.12: α – Tocopherol .......................................................................................18

Hình 2.13: Vitamin C ...............................................................................................19

Hình 2.14: Phản ứng của quecetin với gốc tự do superoxid..................................21

Hình 2.15: Phản ứng trung hòa gốc DPPH............................................................23

Hình 2.16: Phương pháp khuếch tán đĩa................................................................29

Hình 2.17: Kết quả của thử nghiệm Agar Dilution ................................................30

Hình 2.18: Broth Dilution Method ..........................................................................33

Hình 2.19: Micro – broth Methods..........................................................................34

Hình 2.20: TCL bioautography................................................................................35

Hình 2.21: Vi khuẩn E.coli ......................................................................................36

Nghiên Cứu Khoa Học GVHD: Th.S Tạ Đăng Khoa

SVTH: Huỳnh Thị Tường Vi Trang vi

Hình 2.22: Khẩn lạc E.coli.......................................................................................36

Hình 2.23: Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa .....................................................38

Hình 2.24: Khuẩn lạc Pseudomonas aeruginosa....................................................39

Hình 2.25: Vi khuẩn Salmonella enterica typhi .....................................................40

Hình 2.26: Khuẩn lạc Salmonella sp.......................................................................41

Hình 2.27: Vi khuẩn Staphylococcus aureus..........................................................42

Hình 2.28: Hình thái vi khuẩn Staphylococcus aureus .........................................43

Hình 2.29: Hình thái khuẩn lạc S.aureus trên hai môi trường nuôi cấy ..............44

Hình 3.1: Quy trình trích ly dịch chiết lá gai..........................................................50

Hình 3.2: Sơ đồ nghiên cứu.....................................................................................54

Hình 3.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát nồng độ dung môi trích ly .................56

Hình 3.4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm kha sát tỉ lệ nguyên liệu : dung môi ................58

Hình 3.5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát nhiệt độ - thời gian trích ly................61

Hình 4.1: Kết quả xác định hoạt chất sinh học Flavonoid ....................................67

Hình 4.2: Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của nồng độ dung môi ethanol đến quá trình

trích ly........................................................................................................................69

Hình 4.3: Đồ thị thị thể hiện ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu – dung môi đến quá

trình trích ly...............................................................................................................71

Hình 4.4: Đồ thị thể hiện sự ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến quá trình

trích ly........................................................................................................................73

Hình 4.5: Kết quả chống oxy hóa ............................................................................75

Hình 4.6: Mối tương quan giữa nồng độ và hoạt tính chống oxy hóa của cao chiết

lá gai và vitamin C ....................................................................................................76

Nghiên Cứu Khoa Học GVHD: Th.S Tạ Đăng Khoa

SVTH: Huỳnh Thị Tường Vi Trang vii

Hình 4.7: Khả năng kháng khuẩn gây bệnh của dịch chiết lá gai ........................78

Hình 4.8: Màu sắc dịch lá gai ở các tỉ lệ phối trộn khác nhau..............................79

Nghiên Cứu Khoa Học GVHD: Th.S Tạ Đăng Khoa

SVTH: Huỳnh Thị Tường Vi Trang viii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Bảng giá trị dinh dưỡng cây lá gai...........................................................9

Bảng 3.1: Bảng các phương pháp phân tích...........................................................48

Bảng 3.2: Phương pháp phân tích các chỉ tiêu nguyên liệu ban đầu....................54

Bảng 3.3: Bảng bố trí thí nghiệm khảo sát nồng độ dung môi ..............................55

Bảng 3.4: Bảng bố trí thí nghiệm khảo sát tỉ lệ nguyên liệu : dung môi...............57

Bảng 3.5: Bảng bố trí thí nghiệm khảo sát nhiệt độ - thời gian trích ly ................60

Bảng 3.6: Bố trí thí nghiệm thử hoạt tính chống oxy hóa của lá gai ....................62

Bảng 4.1: Kết quả khảo sát nguyên liệu ban đầu ...................................................67

Bảng 4.2: Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến quá trình trích ly ....................68

Bảng 4.3: Ảnh hưởngcủa tỉ lệ nguyên liệu – dung môi đến quá trình trích ly .....70

Bảng 4.4: Ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ đến qáu trình trích ly ................72

Bảng 4.5: Giá trị OD và HTCO (%) của cao chiết lá gai và vitamin C .................75

Bảng 4.6: Khả năng kháng khuẩn của dịch chiết lá gai bằng ethanol .................78

Nghiên Cứu Khoa Học GVHD: Th.S Tạ Đăng Khoa

SVTH: Huỳnh Thị Tường Vi Trang 1

Phần I: GIỚI THIỆU

Nghiên Cứu Khoa Học GVHD: Th.S Tạ Đăng Khoa

SVTH: Huỳnh Thị Tường Vi Trang 2

1.1 Đặt vấn đề

Hàng ngày cơ thể chúng ta luôn phải chịu sự tấn công của các gốc tự do độc hại.

Mỗi ngày một tế bào phải hứng chịu 10,000 đợt tấn công của các gốc tự do. Và trong

suốt 70 năm cuộc đời, chúng ta sẽ phải liên tục chống chọi với 17 tấn gốc tự do. Vì vậy

mà quá trình lão hóa trong cơ thể diễn ra nhanh chóng. Nguy hại hơn những gốc chất

này có thể gây ra những bệnh tật nguy hiểm cho con người. Theo thời gian các gốc tự do

không ngừng sinh ra và gây nguy hại trong khi hệ thống phòng vệ của cơ thể yếu dần.

Do đó, ngoài việc hạn chế các tác nhân gây tăng sinh gốc tự do, chúng ta cần có chế độ

ăn uống phù hợp, bổ sung chất chống gốc tự do chính là các chất chống oxy hóa để cơ

thể tăng khả năng phòng vệ và hạn chế tác động của gốc tự do. Tuy nhiên, các chất chống

oxy hóa này phải an toàn cho cơ thể cũng như dễ tìm và rẻ. Để có được những đặc tính

đó thì các chất chống oxy hóa đi từ các nguồn tự nhiên ngày càng được quan tâm nghiên

cứu.

Cây lá gai là một loài cây khá phổ biến ở Việt Nam cũng như nhiều nước trên thế

giới, chúng phân bố từ bắc vào nam bởi cây dễ trồng, dễ sống và dễ phát triển. Cây lá

gai thường chỉ được sử dụng để làm sợi đan lưới hoặc dệt vải và phần còn lại là đọt non

và lá với khối lượng lớn thì hầu như rất ít được sử dụng. Lá gai chủ yếu được dùng để

chế biến một loại bánh cổ truyền Việt Nam là bánh ít lá gai. Bên cạnh đó, theo kinh

nghiệm dân gian lá gai còn được sử dụng trong đông y như một loại thảo dược để cầm

máu, làm lành vết thương hay làm thuốc an thần. Tuy nhiên, các nghiên cứu về lá gai

còn hạn chế nên ít ai biết được rằng trong lá gai có chứa những hợp chất phenolic có khả

năng chống oxy hóa và diệt khuẩn cao.

Nhằm khẳng định các hợp chất quý giá của lá gai và tận dụng nguồn nguyên liệu

dồi dào đang bị bỏ phí chúng tôi quyết định thực hiện đề tài “Nghiên Cứu Hoạt Tính

Chống Oxy Hóa Và Kháng Escherichia coli Của Lá Gai (Boehmeria nivea)”.