Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hóa học và phân lập chất trong một số dịch chiết lá cây đu đủ đực trên địa bàn thành phố đà nẵng

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

------------

NGUYỄN THỊ QUỲNH MAI

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH

THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ PHÂN LẬP CHẤT

TRONG MỘT SỐ DỊCH CHIẾT LÁ CÂY ĐU ĐỦ ĐỰC

TRÊN ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ ĐÀ NẴNG

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

Mã số: 8440114

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÓA HỌC

Đà Nẵng - Năm 2018

Công trình được hoàn thành tại

Trường Đại học Sư phạm – ĐHĐN

Người hướng dẫn khoa học:

GS.TS. Đào Hùng Cường

Phản biện 1:

PGS.TS. Lê Tự Hải

Phản biện 2:

PGS.TS. Trần Thị Xô

Luận văn được bảo vệ trước Hội đồng chấm Luận văn tốt

nghiệp thạc sĩ Hóa hữu cơ họp tại Đại học Sư phạm – ĐHĐN

từ ngày 06 đến ngày 07 tháng 10 năm 2018.

Có thể tìm hiểu luận văn tại:

- Trung tâm Thông tin – Học liệu, Đại học Đà Nẵng

- Thư viện Trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng

1

MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài

Cây Đu đủ có tên khoa học Carica Papaya L., thuộc họ Đu đủ

(Caricaceae). Trong dân gian lá cây Đu đủ được sử dụng để sát

khuẩn, kháng nấm, kháng viêm, chữa sốt rét, trừ giun sán,…Đã có

nhiều công trình nghiên cứu về hoạt tính sinh học của lá Đu đủ. Lá

Đu đủ được chứng minh là có khả năng chống oxy hóa rất mạnh. Lá

Đu đủ có hoạt tính kháng khuẩn tốt, có khả năng kháng nhiều loại vi

khuẩn gram âm, gram dương, các loại nấm. Ngoài ra, lá Đu đủ còn

có khả năng kháng viêm, giảm đau.

Tại Việt Nam, cao chiết với cồn từ lá Đu đủ được nghiên cứu

trong một số mô hình ung thư thực nghiệm và được chứng minh có

tác dụng ức chế sự phát triển của khối u gây bởi tế bào ung thư

Sarcoma TG-180 ở chuột nhắt trắng. Đầu năm 2010, một nhóm

nghiên cứu Nhật Bản và Mỹ đã thông báo dịch chiết nước lá cây Đu

đủ có tác dụng ức chế một số dòng tế bào ung thư người như ung thư

dạ dày, ung thư phổi, ung thư máu,...

Ngày nay, sử dụng một sô bộ phận của cây Đu đủ để chữa

bệnh chủ yếu theo kinh nghiệm dân gian nên việc tìm hiểu thành

phần hóa học và chứng minh được thành phần hoạt chất cụ thể của

một số bộ phận cây Đu đủ là rất cần thiết, làm tiền đề khoa học cho

việc ứng dụng nguồn nguyên liệu sẵn có ở Việt Nam bào chế thuốc

điều trị các căn bệnh hiểm nghèo, trong đó có bệnh ung thư. Hiện

nay, các công trình nghiên cứu thành phần hóa học về các bộ phận

của cây Đu đủ trong đó chỉ đề cập đến lá Đu đủ nói chung mà ít quan

tâm đến lá Đu đủ đực. Tại Việt Nam, vẫn chưa có nhiều nghiên cứu

về xác định thành phần hóa học của lá cây Đu đủ đực. Vì vậy, để góp

2

phần làm phong phú thêm sơ ở dữ liệu về cây Đu đủ nói chung và

cây Đu đủ đực nói riêng, học viên chọn đề tài “Nghiên cứu chiết

tách, xác định thành phần hóa học và phân lập chất trong một số

dịch chiết lá cây Đu đủ đực trên địa bàn thành phố Đà Nẵng”.

2. Mục đích nghiên cứu

Xây dựng quy trình chiết tách lá Đu đủ đực.

Khảo sát một số điều kiện ảnh hưởng đến quá trình chiết.

Khảo sát hoạt tính sinh học của một số dịch chiết.

Xác định thành phần hóa học trong một số dịch chiết.

Phân lập và xác định công thức hóa học trong dịch chiết.

3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

3.1. Đối tượng

Lá Đu đủ đực được hái trên đại bàn thành phố Đà Nẵng.

3.2. Phạm vi nghiên cứu

Xác định một số chỉ tiêu hóa lý của lá Đu đủ đực.

Khảo sát điều kiện chiết của dịch chiết lá Đu đủ đực trong 4

dung môi n-hexane, chloroform, ethyl acetate và n-butanol qua 3

phương pháp chiết (ngâm dầm, soxhlet và siêu âm) để chọn phương

pháp chiết tối ưu nhất.

Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào của 4 dịch chiết (n-hexane,

chloroform, ethyl acetate và n-butanol) đối với 3 dòng tế bào ung thư

phổi, ung thư gan, ung thư vú.

Định danh thành phần hóa học của lá Đu đủ đực trong các

dung môi n-hexane, chloroform, ethyl acetate và n-butanol.

Chọn dung môi phù hợp và phân lập làm giàu một số phân

đoạn, xác định công thưc hóa học có trong dịch chiết lá cây Đu đủ

đực.

3

4. Phương pháp nghiên cứu

4.1. Phương pháp nghiên cứu lý thuyết

4.2. Phương pháp thực nghiệm

5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

5.1. Ý nghĩa khoa học

Cung cấp các thông tin khoa học về thành phần hóa học của

dịch chiết lá cây Đu đủ đựcbằng các dung môi khác nhau.

Xác định công thức hóa học của một hợp chất có trong lá cây

Đu đủ đực.

Cung cấp các số liệu thực nghiệm cho các nghiên cứu chuyên

sâu sau này về lá cây Đu đủ đực.

5.2. Ý nghĩa thực tiễn

Từ số liệu về thành thành phần hóa học và thử hoạt tính sinh

học của dịch chiết lá cây Đu đủ đực trong các dung môi khác nhau

để có thể đưa ra các ứng dụng trong thực tế cũng như mở rộng phạm

vi nghiên cứu về sau.

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN VỀ CÂY ĐU ĐỦ

1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÂY ĐU ĐỦ

1.1.1. Tên gọi

Tên khoa học là Carica Papaya L., thuộc họ Caricaceae.

Tên khác phiên mộc, cà lào, phiên qua, phan qua thụ, lô hong

phlê (Campuchia), mắc hung (Lào), má hống (Thái).

1.1.2. Nguồn gốc, phân bố

Trên thế giới, các nước trồng nhiều Đu đủ như Ấn Độ, Trung

Quốc, Thái Lan, Philipin, Mianma, Malaysia (Châu Á); Tazania,

Uganda (châu Phi); Brazin, Mỹ (châu Mỹ); Úc, Newzealand (châu

4

Đại Dương). Ở Việt Nam chưa xác định được nguồn gốc và xuất xứ

của cây Đu đủ nhưng đến nay hầu hết các tỉnh từ Bắc vào Nam đều

trồng Đu đủ, nhiều nhất là ở các tỉnh miền Đông Nam Bộ và Tây

Nguyên.

1.1.3. Đặc điểm hình thái

Cây Đu đủ là loại cây nhỏ hoặc nhỡ, cao từ 2 - 4 mét, thân

thẳng, không phân nhánh. Lá to, mọc so le, tập trung ở ngọn. Cuống

lá rất dài, xẻ 5 - 7 thùy sâu, gốc hình tim, đầu nhọn, mỗi thùy lại chia

tiếp thành nhiều thùy nhỏ không đều, gân lá hình chân vịt, hai mặt

nhẵn.

1.1.4. Thành phần hóa học

Quả Đu đủ chín chứa chừng 90% nước, các chất đường trong

đó chủ yếu là glucoza 8,5%, một ít protein, chất béo, một ít muối vô

cơ (canxi, photpho, sắt), vitamin A, B và C.

Trong lá, quả và hạt (chủ yếu ở lá) có một chất alkaloid đắng

gọi là cacpain và chất glucoxit gọi là cacpozit.

Trong rể người ta thấy nhiều kali myronat, trong lá nhiều

myrozin, trong vỏ hạt nhiều myrozin và không có kali myronat.

Trong hạt Đu đủ, theo Hooper có 26,3% dầu; 24,3% chất

anbuminôit; 17% sợi, 15,5% hydrat cacbon; 8,8% tro và 82% nước.

1.2. NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA

LÁ ĐU ĐỦ

1.2.1. Tác dụng kháng sinh, kháng nấm.

1.2.2. Tác dụng trị u bướu, ung thư.

1.2.3. Tác dụng chống oxi hóa.

1.2.4. Các tác dụng dược lý khác.

1.2.5. Công dụng trong dân gian.

5

1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ LÁ ĐU ĐỦ

1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Năm 2002, David và cộng sự đã xác định được glycosid là

prunasin và sambunigrin trong lá và thân Đu đủ.

Năm 2007, Antonella Canini và cộng sự nghiên cứu các hợp

chất phenol trong lá Đu đủ.

Năm 2008, Krishna K.L và cộng sự đã tổng hợp các công trình

nghiên cứu về thành phần hóa học các bộ phân cây đu đủ.

1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước

Năm 2007, Hà Thị Bích Ngọc và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật

HPLC phân tích các chất carotenoid trong lá Đu đủ.

Năm 2012, Trần Thanh Hà đã phân lập được 4 chất từ phân

đoạn chiết n-hexan của lá Đu đủ. Trong đó, sterculin A và cycloart￾25-ene-3β,24 (R/S)- diol là 2 tritecpen lần đầu tiên phân lập.

Năm 2014, Hồ Thị Hà đã tiến hành chiết phân đoạn dịch chiết

MeOH từ lá Đu đủ bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần (n￾hexan, CH2Cl2, EtOAc, buthanol). Từ cặn chiết CH2Cl2 phân lập

được 6 hợp chất: danielone, carpainone, axit pluchoic, apocynol A,

carpaine, pseudocarpaine. Trong đó carpainone là hợp chất mới và 2

chất danielone và apocynol A lần đầu tiên được chiết ra từ lá đu đủ.

CHƯƠNG 2. NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM

2.1. NGUYÊN LIỆU

2.1.1. Đối tượng thực nghiệm

Nguyên liệu: lá Đu đủ đực được hái ở địa bàn thành phố Đà

Nẵng.

6

2.1.2. Xử lý nguyên liệu

Lá Đu đủ đực được lựa chọn phải có màu xanh mướt, không

non không già.Sau khi hái đem vào bỏ cuống, rửa sạch rồi thái nhỏ

khoảng 1 -2 cm, vẩy cho ráo nước. Đem ra chỗ nắng to, phơi thật

khô rồi đem xay nhỏ thành bột để sử dụng cho nghiên cứu.

2.2. THIẾT BỊ, DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT

2.2.1. Thiết bị, dụng cụ

Tủ sấy Controller B170 của Đức;

Thiết bị đo sắc ký khí ghép phổ khối (GS–MS) Aligent

7890A/5075C;

Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) 800 Aligent;

Đèn tử ngoại bước sóng λ = 254nm và 365nm dùng để soi bản

mỏng;

Máy cất quay chân không Bunchi-Vacuum Controller V800;

Thiết bị sắc ký cột và sắc ký bản mỏng;

Một số thiết bị khác như: máy siêu âm, bộ chiết soxhlet và các

dụng cụ cần thiết khác trong PTN (cốc thủy tinh, bình tam giác, bếp

cách thuỷ, cốc sứ, pipet, bình định mức, phễu, giấy lọc,…).

2.2.2. Hóa chất

Ngoài các loại hóa chất chính được trình bày trong Bảng 2.1,

học viên còn sử dụng thêm các loại hóa chất khác như: C2H5OH 950

,

NH4OH, HNO3, HCl, KI, HgCl2, sillica gel, …

2.3. PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM

2.3.1. Phương pháp xác định các thông số hóa lý

2.3.2. Phương pháp chiết bằng các dung môi hữu cơ

2.3.3. Phương pháp định danh thành phần hóa học

2.3.4. Phương pháp tách và xác định cấu trúc hợp chất

7

2.4. THỰC NGHIỆM

2.4.1. Xác định các thông số hóa lý và kim loại

a. Sơ đồ khảo sát

Hinh 2.3. Sơ đồ khảo sát

b. Xác định độ ẩm

c. Xác định hàm lượng tro

d. Xác định hàm lượng một số kim loại

2.4.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng cao

chiết (phương pháp chiết rắn - lỏng)

a. Chiết bằng phương pháp siêu âm

b. Chiết bằng phương pháp Soxhlet

c. Chiết bằng phương pháp ngâm dầm

chloroform

Xác định độ ẩm,

hàm lượng tro. Xử lý mẫu

Lá Đu đủ đực:

sấy khô, xay mịn

Bột mẫu

Xác định hàm

lượng kim loại

Dịch chiết

n-hexan

n-hexan Ethyl acetate

Dịch chiết

chloroform

Dịch chiết

Ethyl acetate

Dịch chiết

n-Butanol

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng cao chiết

n-butanol

8

2.4.3. Định tính một số hợp chất trong lá Đu đủ đực

2.4.4. Quy trình điều chế cao chiết

a. Sơ đồ điều chế cao chiết

Hình 2.4. Sơ đồ điều chế cao chiết

b. Điều chế cao tổng MeOH

c. Điều chế các cao n-hexane, cao chloroform, cao EtOAc và

cao BuOH

1. Ngâm, chiết kiệt trong MeOH (24 giờ)

2. Cất loại dung môi dưới áp suất thấp

Nguyên liệu:

Lá Đu đủ đực sấy khô, xay mịn (5kg)

Cao tổng MeOH

Cao n-hexan Cao CHCl3 Cao EtOAc Cao BuOH

Phân lập chất tinh khiết

Khảo sát hoạt

tính sinh học

1. Chiết lần lượt với các dung môi: n-hexane;

chloroform; EtOAc; BuOH.

2. Cất loại dung môi dưới áp suất thấp

Chọn cao chiết

thích hợp trong 4

loại cao trên để

tiến hành phân lập

Phân lập chất tinh khiết

IR

MS

13C-NMR 1

H-NMR

Định danh thành

phần hóa học

GC-MS

9

d. Phương pháp tách chất tinh khiết và xác định công thức

câu tạo

2.4.5. Thử hoạt tính sinh học của các dịch chiết

a. Quy trình chiết xuất dịch chiết

b. Phương pháp thử độc tế bào

2.4.6. Định danh thành phần hóa học trong 4 cao chiết n￾hexane, chloroform, EtOAc và BuOH

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. XÁC ĐỊNH CÁC THÔNG SỐ HÓA LÝ

3.1.1. Xác định độ ẩm và hàm lượng tro

- Độ ẩm: Độ ẩm trung bình của bột mẫu nguyên liệu lá Đu đủ

đực được nghiên cứu khoảng 10,332%;

- Hàm lượng tro: Dựa vào kết quả thu được, hàm lượng tro

trung bình của nguyên liệu khoảng 6,718%.

3.1.2. Xác định hàm lượng các kim loại

Từ kết quả thực nghiệm và so sánh với Quyết định số

46/2007/QĐ-BYT ngày 19/12/2007 của Bộ trưởng Bộ Y tế về việc

ban hành “quy định giới hạn tối đa ô nhiễm sinh học và hóa học

trong thực phẩm” và QCVN 8-2:2011/BYT (được ban hành theo

Thông tư số 02/2011/TT-BYT ngày 13/01/2011 của Bộ trưởng Bộ y

tế) “Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia đối với giới hạn kim loại nặng

trong thực phẩm” đối với loại thực phẩm tương đương là “chè và sản

phẩm chè” nhận thấy, các thông số kim loại đều có giá trị thấp hơn

so với giới hạn cho phép. Đặc biệt, hàm lượng các kim loại nặng (Pb,

Cd, Hg và As) thấp hơn so với mức an toàn trong một số dược liệu

được quy định tại Dược điển Việt Nam IV (<2x10-6 mg/kg). Vì vậy,

10

hàm lượng các kim loại trong lá Đu đủ đực không gây ảnh hưởng

đến sức khỏe con người khi sử dụng làm dược liệu.

3.2. KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHỐI

LƯỢNG CAO CHIẾT

3.2.1. Chiết bằng Soxhlet

Hình 3.1. Khảo sát thời gian chiết tối ưu bằng soxhlet

Ở thời gian đầu lượng cao chiết tăng theo thời gian, tuy nhiên

đến khoảng thời gian từ 4 giờ trở đi (đối với n-butanol) và từ 6 giờ

(đối với n-hexane, chloroform và ethyl acetate) thì khối lượng cao

thu được tăng không đáng kể. Nguyên nhân là do khi tăng thời gian

chiết, các cấu tử có trong bột lá Đu đủ hòa tan trong dung môi càng

nhiều, thời gian chiết càng lâu thì hàm lượng các cấu tử có trong cao

chiết càng tăng dẫn đến khối lượng cao chiết tăng đều lên. Đến

khoảng thời gian nhất định, khi các cấu tử đã hòa tan gần hết trong

dung môi thì khối lượng cao chiết sẽ tăng chậm và không đáng kể.Vì

vậy, thời gian chiết tối ưu để thu được khối lượng cao chiết lớn nhất

với tỉ lệ 1/20 theo khảo sát cụ thể là: dung môi n-hexane là 6 giờ,

chloroform là 6 giờ, ethyl acetate là 6 giờ và n-butanol là 4 giờ.