Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hóa học và phân lập chất trong một số dịch chiết của vỏ cây hoa sữa trên địa bàn thành phố đà nẵng

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN THỊ NHƯ NGỌC

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH THÀNH

PHẦN HÓA HỌC VÀ PHÂN LẬP CHẤT TRONG MỘT

SỐ DỊCH CHIẾT CỦA VỎ CÂY HOA SỮA TRÊN ĐỊA

BÀN THÀNH PHỐ ĐÀ NẴNG

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

Mã số : 8 44 01 14

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÓA HỌC

Đà Nẵng - Năm 2018

Công trình được hoàn thành tại

Trường Đại học Sư phạm - ĐHĐN

Người hướng dẫn khoa học: GS.TS. ĐÀO HÙNG CƯỜNG

Phản biện 1: PGS.TS. GIANG THỊ KIM LIÊN

Phản biện 2: TS. HUỲNH THỊ KIM CÚC

Luận văn sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm Luận văn tốt

nghiệp Thạc sĩ Hóa học họp tại Trường Đại học Sư phạm –

ĐHĐN vào ngày 6-7 tháng 10 năm 2018

Có thể tìm hiểu luận văn tại:

- Trung tâm Thông tin - Học liệu, Đại học Đà Nẵng;

- Thư viện trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng.

1

MỞ ĐẦU

1. LÍ DO CHỌN ĐỀ TÀI

Việt Nam ta là một nƣớc nhiệt đới, nóng, ẩm và mƣa nhiều, có

nguồn dƣợc liệu rất phong phú, đa dạng và một nền y học dân tộc

phát triển lâu đời. Từ xa xƣa, ông cha ta đã biết cách sử dụng nhiều

loại thảo dƣợc trong việc dƣỡng thƣơng, trị bệnh và bồi bổ cơ thể.

Nhƣ vậy, những cây thuốc dân gian đóng vai trò hết sức quan trọng

trong đời sống hằng ngày của con ngƣời.

Ngày nay, khi biệt dƣợc của nền y học hiện đại đƣợc sử dụng

rộng rãi, nhiều loài cây cỏ trong tự nhiên vẫn đƣợc sử dụng trong dân

gian để chữa bệnh rất có hiệu quả. Nhiều loại bệnh tật đã đƣợc chữa

khỏi nhờ thảo dƣợc, trong đó rất nhiều thực vật đƣợc dùng để chế

biến thành thực phẩm chức năng quí giá. Trong thời gian qua, những

hợp chất tự nhiên đƣợc phân lập từ thực vật đã đƣợc ứng dụng rộng

rãi trong rất nhiều ngành công nghiệp, nông nghiệp, chúng đƣợc

dùng để sản xuất thuốc chữa bệnh, thuốc bảo vệ thực vật, làm nguyên

liệu cho ngành công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm v.v... Cây hoa

sữa là một cây thƣờng xanh có thể đạt chiều cao lên đến 40 m. Vỏ

cây đƣợc sử dụng chủ yếu trong y học. Nó đƣợc coi là một loại thuốc

bổ, hạ sốt, chữa sốt rét, bệnh phong, bệnh ngoài da, ngứa, khối u, ung

loét mãn tính, hen suyễn, viêm phế quản, suy nhƣợc cơ thể, tiêu chảy,

kiết lỵ và khó tiêu.

Cho đến nay ở nƣớc ta chƣa có nhiều nghiên cứu mang tính cơ

bản về thành phần, tính chất, khả năng ứng dụng của các hợp chất có

trong vỏ cây hoa sữa. Với những lí do trên, chúng tôi quyết định chọn

đề tài: “Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hóa học và

2

phân lập chất trong một số dịch chiết của vỏ cây hoa sữa trên địa

bàn thành phố Đà Nẵng ” nhằm góp phần nâng cao giá trị khoa học

và giá trị sử dụng của vỏ cây hoa sữa trong y học.

2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tƣợng

Vỏ cây hoa sữa, đƣợc lựa chọn một cách ngẫu nhiên trên địa

bàn thành phố Đà Nẵng.

2.2. Phạm vi nghiên cứu

- Nghiên cứu trên nguồn nguyên liệu tại thành phố Đà Nẵng.

- Phân lập, tinh chế một số hợp chất hóa học có trong mẫu cao

chiết từ vỏ cây hoa sữa.

- Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập đƣợc.

- Thăm dò hoạt tính sinh học của một số hợp chất phân lập

đƣợc.

3. MỤC TIÊU VÀ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU

3.1. Mục tiêu nghiên cứu

- Xây dựng qui trình chiết tách các hợp chất từ vỏ cây hoa sữa.

- Phân lập một số hợp chất hóa học trong một số dịch chiết

của vỏ cây hoa sữa.

- Xác định cấu trúc các hợp chất đã phân lập đƣợc.

3.2. Nhiệm vụ nghiên cứu

- Nghiên cứu, xác định cấu trúc của một số hợp chất hóa học của vỏ cây

hoa sữa.

4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Để thực hiện đề tài này, tôi sử dụng các phƣơng pháp nghiên

cứu sau:

3

4.1. Nghiên cứu lý thuyết

- Thu thập, tổng hợp các tài liệu, tƣ liệu, sách báo trong và

ngoài nƣớc có liên quan đến đề tài.

- Hội thảo, trao đổi kinh nghiệm với các chuyên gia, thầy cô

giáo và cộng sự.

4.2. Phƣơng pháp thực nghiệm

- Phƣơng pháp chọn, thu hái và xử lí mẫu.

- Phƣơng pháp xác định các chỉ số hóa lí.

- Phƣơng pháp chiết, phân lập chất.

- Các phƣơng pháp xác định cấu trúc: kết hợp các phƣơng pháp

đo phổ hồng ngoại T–IR , phổ khối MS , phổ cộng hƣởng từ hạt

nhân một chiều 1 NMR : 1H–NMR, 13C–NMR, PT, cộng

hƣởng từ hạt nhân hai chiều 2 NMR : COS , NO S , HSQC,

HM C và các phƣơng pháp khác để xác định cấu trúc của các chất

phân lập đƣợc.

- Các phƣơng pháp thử hoạt tính sinh học: thử hoạt tính kháng

khuẩn, kháng viêm, chống oxi hoá, gây độc tế bào ung thƣ.

5. BỐ CỤC LUẬN VĂN

Luận văn bao gồm 78 trang, 18 bảng, 31 hình, ảnh, 32 tài liệu

tham khảo. Với:

Phần mở đầu 3 trang

Chƣơng 1 – TỔNG QUAN (11 Trang)

Chƣơng 2 – NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU ( 23 Trang )

Chƣơng 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 Trang)

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 2 Trang)

TÀI LIỆU THAM KHẢO (4 Trang)

4

CHƢƠNG 1

TỔNG QUAN

1.1. GIỚI THIỆU VỀ HỌ APOCYNACEAE VÀ CÂY HOA

SỮA

1.1.1. Họ Apocynaceae

1.1.2. Cây hoa sữa

a. Đặc điểm sinh thái

b. Đặc tính thực vật

c. Công dụng của cây hoa sữa

1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU Ở VIỆT NAM VÀ TRÊN THẾ

GIỚI VỀ CÂY HOA SỮA ( ALSTONIA SCHOLARIS )

1.2.1. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

1.2.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới

CHƢƠNG 2

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ THÍ NGHIỆM

2.1.1. Nguyên liệu

Vỏ cây hoa sữa cây mù cua, mò cua đƣợc thu hái tháng

11/2017 tại Đà Nẵng Trƣờng Đại học Sƣ phạm ) đƣợc rửa sạch,

phơi, sấy khô ở nhiệt độ 50-600C rồi xay thành bột mịn để chiết lần

lƣợt với các dung môi n–hexane, chloroform, ethyl acetate và

methanol.

2.1.2. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

5

2.2.1. Các phƣơng pháp xác định chỉ tiêu hóa lí

2.2.2. Phƣơng pháp chiết mẫu thực vật

2.2.3. Phƣơng pháp định tính một số lớp chất trong vỏ cây

hoa sữa

2.2.4. Phƣơng pháp khảo sát sơ bộ thành phần hóa học của

các cao chiết

Sau khi khảo sát thời gian chiết tối ƣu với từng dung môi bằng

dụng cụ chiết soxhlet, trích lấy cao ở mỗi dịch chiết để đo phổ GC￾MS để định danh sơ bộ một số hợp chất có trong bốn mẫu cao chiết

tại Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc, mỹ phẩm, thực phẩm Thừa Thiên

Huế - 17 Trƣơng Định, Thành phố Huế, tỉnh Thừa Thiên Huế.

2.2.5. Phƣơng pháp thăm dò hoạt tính sinh học

2.2.6. Phƣơng pháp phân lập các chất

2.2.7. Phƣơng pháp xác định cấu trúc hóa học của các chất

2.3. CÁC SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM

2.3.1. Sơ đồ khảo sát sơ bộ một số yếu tố

Các quá trình khảo sát đƣợc mô tả theo Hình 2.2

2.3.2. Sơ đồ điều chế các cao chiết

Các quá trình thực nghiệm đƣợc mô tả theo Hình 2.3

Từ 3 kg bột vỏ cây hoa sữa sau khi đƣợc ngâm chiết lần lƣợt với các

dung môi n–hexane, chloroform, ethyl acetate và methanol ( rắn :

lỏng = 1:2 thu đƣợc dịch chiết, rồi đuổi dung môi bằng cất quay

chân không thu đƣợc các cao chiết tƣơng ứng.

2.3.3. Sơ đồ phân lập cao chiết n-hexane

Trong phạm vi đề tài, dựa vào % cao chiết so với mẫu bột

nguyên liệu ban đầu, thành phần định danh, hoạt tính sinh học và

6

Chiết soxhlet

nghiên cứu tài liệu tham khảo, chúng tôi tiến hành phân lập cao chiết

n-hexane.

Hình 2.2. Sơ đồ khảo sát một số yếu tố

GC-MS

Thử hoạt tính sinh học

Cao ( H )

n- hexane

Cao ( C )

chloroform

Cao ( E)

ethyl

acetate

Cao ( M )

methanol

Định danh

H

Định danh

C

Định danh

E

Định

danh

M

GC-MS GC GC-MS -MS

Vỏ cây

hoa sữa

ột nguyên liệu

Xác định các

chỉ tiêu hóa lí

Định tính

các lớp chất

Cất loại

dung môi

Cất loại

dung môi

ịch chiết

n- hexane

ịch chiết

ethyl acetate

ịch chiết

chlorofor

m

ịch chiết

methanol

7

Ngâm chiết với

etyl acetate

5 lần x 24h

Hình 2.3. Sơ đồ điều chế các cao chiết

Ngâm chiết với

chloroform

5 lần x 24h

Vỏ cây hoa

sữa

Xử lí

ột nguyên liệu

(3kg )

Ngâm chiết với n- hexane

5 lần x 24h

ịch chiết

n- hexane

Cất loại

dung môi

Cao ( H )

n- hexane

Phân lập

chất

Đo phổ IR, MS, 1H-NMR,

13C-NMR, DEPT, HMBC,

HSQC..để xác định cấu trúc

ịch chiết

chloroform

ã rắn 1

Cất loại

dung môi

Cao ( C )

chloroform

ã rắn 2

ịch chiết

etyl acetate

ã rắn 3

Cất loại

dung môi

Cao ( E )

etyl acetate

Ngâm chiết với

methanol

5 lần x 24h

ịch chiết

methanol

Cất loại

dung môi

Cao ( M )

methanol

8

Hình 2.4. Sơ đồ phân lập chất từ cao n-hexane

Cao n- hexane (H)

(7g)

SKC, silicagel, gradient

HA 100:00:100, 120 lọ

V1 V2 V3 V

4

V5 V

6

V7 V8 V9 V10 V11 V12

SKC, silicagel,

HA 20/1, 105 lọ

ASVH

300 mg

ASVH10

75 mg

VH1 VH2 VH3 VH4 VH5 VH6 VH7 VH8

9

b = 10 cm

7 g cao n-hexane trộn với 10g silicagel đƣợc nạp vào cột bằng

phƣơng pháp nạp mẫu khô. Silicagel đƣợc nhồi vào cột bằng phƣơng

pháp ƣớt huyền phù . Chạy cột với hệ dung môi rửa giải gradient

n-hexane/ acetone: 100/0-0/100 thu đƣợc 120 lọ, mỗi lọ khoảng

15ml. Sau đó chấm bản mỏng 120 lọ đƣợc gộp thành 12 phân đoạn,

kí hiệu từ V1-V12: V1 = (1 - 9), V7 = (53-62), V2 = (10-17), V8 =

(63-79), V3 = (18-22), V9 = (80-90), V4 = (23-30), V10 = (91-102),

V5= (31-38), V11= (103-110)V6= (39-52), V12 = (111-120).

Sau khi chấm bản mỏng các phân đoạn thì nhận thấy phân

đoạn V8 có sự tách vệt rõ ràng ( ảng 2.1 ), ít tạp chất nên chúng tôi

tiếp tục tinh chế phân đoạn V8

Bảng 2.1. Sắc ký bản mỏng V8

Phân đoạn V8 đƣợc cất loại dung môi thu đƣợc 300mg cặn,

kí hiệu ASVH.

Chúng tôi tiến hành chạy cột với 300mg ASVH, mẫu đƣợc nạp

bằng phƣơng pháp khô và silicagel đƣợc nạp vào cột bằng phƣơng

pháp ƣớt huyền phù . Hệ dung môi rửa giải là hệ dung môi n￾hexane/ acetone : 20/1. Sau khi chạy cột thứ hai này, chúng tôi thu

Sắc ký bản mỏng Nhóm chất 1 2 3

Rf = ai

/b

0.3 0.5 0.8 a1 = 0.3 cm

a2 = 0.5 cm

a3 = 0.8 cm

10

đƣợc 105 lọ, mỗi lọ khoảng 7ml. Sau đó chấm bản mỏng, 105 lọ

đƣợc gộp thành 8 phân đoạn, kí hiệu VH1-VH8 : VH1 = (1- 15),VH5

= (66-75),VH2 = (16-37), VH6= (76-82),VH3= (38-50), VH7= (83-

90), VH4= (51-65), VH8= (91-105).

Trong đó phân đoạn VH4 chấm bản mỏng với các hệ

dung môi khác nhau cho một vệt dƣới đèn UV và thuốc thử

( Hình 2.8).

Hình 2.8. Sắc kí bản mỏng VH4

CHƢƠNG 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHỈ SỐ VẬT LÝ

3.1.1. Độ ẩm

Độ ẩm trung bình của bột nguyên liệu khoảng 10.20%.

Với độ ẩm này, nguyên liệu đƣợc bảo quản trong suốt quá trình làm

thực nghiệm không bị nấm mốc, hƣ hại và nằm trong khoảng cho

phép về độ ẩm an toàn của dƣợc liệu vỏ thân cây (10-12%).

3.1.2. Hàm lƣợng tro

Hàm lƣợng tro trung bình của mẫu bột vỏ cây hoa sữa khoảng

8.80 %.

UV

H/A

50/1

H/A

25/1

H/A

20/1

H/C

1/1

H/A

15/1

H/E

90/1

MeOH

11

Hàm lƣợng này có giá trị gần với các loại dƣợc liệu vỏ thân

hay đƣợc dùng trong dân gian, an toàn cho ngƣời sử dụng.

3.1.3. Hàm lƣợng kim loại nặng

Căn cứ vào tiêu chuẩn Việt Nam TCVN cho vệ sinh thực phẩm

theo thông tƣ của bộ y tế số 02/2011/ TT- T về hàm lƣợng kim

loại nặng tối đa cho phép trong rau quả sấy khô là Pb: 2 mg/l, Zn:

40mg/l, Cu: 30 mg /l, As: 1 mg/l, Cd: 0,1 mg/l thì hàm lƣợng kim

loại nặng có trong vỏ cây hoa sữa ít hơn nhiều so với hàm lƣợng tối

đa cho phép. o vậy việc sử dụng vỏ cây hoa sữa làm dƣợc phẩm có

độ an toàn cao.

3.2. XÁC ĐỊNH THỜI GIAN CHIẾT

+ Thời gian chiết tối ƣu với dung môi n- hexane là 6h.

+ Thời gian chiết tối ƣu với dung môi chloroform là 8h.

+ Thời gian chiết tối ƣu với dung môi ethyl acetate là 4h.

+ Thời gian chiết tối ƣu với dung môi methanol là 6h.

3.3. XÁC ĐỊNH CÁC LỚP CHẤT TRONG VỎ CÂY HOA SỮA

Trong 12 lớp chất đƣợc định tính thì mẫu bột nguyên liệu

dùng nghiên cứu có 12 lớp chất đƣợc phát hiện đó là: alkaloid,

flavonoid, steroid, saponin, đƣờng khử, polyphenol, sterol, coumarin,

polysaccarid, carotene, chất béo, iridoid.

3.4. XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG

CÁC DỊCH CHIẾT BẰNG PHƢƠNG PHÁP GC– MS

3.4.1. Định danh một số cấu tử trong dịch chiết n-hexane

3.4.2. Định danh một số cấu tử trong dịch chiết chloroform

3.4.3. Định danh một số cấu tử trong dịch chiết ethyl

acetate

3.4.4. Định danh một số cấu tử trong dịch chiết methanol