Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hóa học trong dịch chiết ethanol – nước của cây cỏ sữa lá nhỏ theo định hướng hạ đường huyết

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN THỊ THU

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH, XÁC ĐỊNH

THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG DỊCH CHIẾT

ETHANOL – NƯỚC CỦA CÂY CỎ SỮA LÁ NHỎ

THEO ĐỊNH HƯỚNG HẠ ĐƯỜNG HUYẾT

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

Mã số : 60 44 01 14

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC

Đà Nẵng - Năm 2017

Công trình được hoàn thành tại

Trường Đại học Sư phạm – ĐHĐN

Người hướng dẫn khoa học: TS. PHẠM VĂN VƯỢNG

Phản biện 1: PGS.TS. Trần Thị Xô

Phản biện 2: GS.TS. Đào Hùng Cường

Luận văn đã được bảo vệ trước Hội đồng chấm Luận văn tốt

nghiệp Thạc sĩ Hoá hữu cơ họp tại Trường Đại học Sư phạm –

ĐHĐN vào ngày 22 tháng 04 năm 2017.

Có thể tìm hiểu luận văn tại:

- Trung tâm Thông tin - Học liệu, Đại học Đà Nẵng;

- Thư viện trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng

1

MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài

Ngày nay, theo thống kê của Hiệp hội Đái tháo đường Quốc

tế, tính đến năm 2013, toàn thế giới có khoảng 382 triệu người mắc

bệnh đái tháo đường, và con số này có xu hướng tăng lên gấp đôi vào

năm 2035, chi phí điều trị dành cho bệnh đái tháo đường ở nhóm

bệnh nhân 20-79 tuổi trên thế giới đạt mức 548 tỷ USD [20]. Hiện

nay, trên thị trường các thuốc điều trị đái tháo đường chủ yếu có

nguồn gốc tổng hợp hóa dược, việc nghiên cứu các thuốc mới có

nguồn gốc từ thiên nhiên đã và đang được các nhà khoa học quan tâm

nghiên cứu nhằm tìm kiếm các thuốc có tác dụng hỗ trợ cho bệnh

nhân trong quá trình điều trị kéo dài, giảm tác dụng không mong

muốn, đồng thời giảm chi phí điều trị.

Ở Việt Nam, cỏ sữa lá nhỏ (Euphorbia thymifolia L., họ

Euphorbiaceae) mọc hoang ở khắp nơi, ưa đất có sỏi, đá, thường thấy

ở các kẽ gạch, sân xi măng, dọc đường xe lửa có dải những hòn đá

vôi xanh. Trên thế giới, cỏ sữa lá nhỏ cũng mọc hoang ở một số nước

như Bangladesh, Ấn Độ. Theo y học cổ truyền, cỏ sữa lá nhỏ được sử

dụng để chữa lỵ, nhất là ở trẻ em [13]; tăng huyết áp, … [32]. Lá và

hạt cỏ sữa lá nhỏ được sử dụng trong chứng rối loạn đường ruột ở trẻ

em và là thuốc nhuận tràng [27]. Đồng thời, hoạt tính kháng khuẩn

của cỏ sữa lá nhỏ đã được phát hiện từ năm 1988 [25].

Cây cỏ sữa lá nhỏ đã được các nhà khoa học trên thế giới và

Việt Nam quan tâm nghiên cứu. Theo Vũ Minh Trang, từ cặn chiết

ethylacetat của lá cây cỏ sữa lá nhỏ thu hái ở Hà Nội đã phân lập

được các chất: apigenin, quercetin, methyl gallate, acid gallic và

apigenin 7-O-β-D-glucopyranoside cùng với acid palmitic và β￾sitosterol [17]. Bên cạnh đó, tác giả này cũng đã phân lập được một

số thành phần dipeptide và glucoside từ lá cỏ sữa lá nhỏ, trong đó

2

luteolin-7-O-β-D-glucopyranoside là hợp chất chính có trong phần

chiết nước [18]. Một số kết quả nghiên cứu sơ bộ tại Việt Nam đã

cho thấy cây cỏ sữa lá nhỏ có tác dụng hạ đường huyết [28] và được

nhân dân sử dụng dưới dạng nước uống hằng ngày [13].

Với những lý do trên, đề tài: “Nghiên cứu chiết tách, xác

định thành phần hóa học trong dịch chiết ethanol – nƣớc của cây

cỏ sữa lá nhỏ theo định hƣớng hạ đƣờng huyết” đã được lựa chọn.

2. Mục tiêu nghiên cứu

1. Phân tích sơ bộ thành phần hóa học của cỏ sữa lá nhỏ thu

hái tại huyện Thăng Bình – tỉnh Quảng Nam.

2. Xác định thành phần hóa học trong dịch chiết ethanol –

nước của cây cỏ sữa lá nhỏ theo định hướng hạ đường huyết.

3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu

Toàn cây Cỏ sữa lá nhỏ (Euphorbia thymifolia L.) được thu

hái tại huyện Thăng Bình – tỉnh Quảng Nam vào tháng 5 năm 2016.

4. Phƣơng pháp nghiên cứu

Đề tài được thực hiện với các phương pháp sau:

4.1. Phương pháp nghiên cứu lý thuyết

- Thu thập, tổng hợp tài liệu, tư liệu và các thông tin liên quan

đến đề tài

- Tìm hiểu về các phương pháp thực nghiệm sử dụng trong quá

trình nghiên cứu

- Xử lý các thông tin về lý thuyết có thể sử dụng được để đưa

ra các vấn đề cần thực hiện trong quá trình thực nghiệm

4.2. Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

- Lấy mẫu, xử lý và sơ chế mẫu

- Xác định một số chỉ tiêu hóa lý của cỏ sữa lá nhỏ:

+ Xác định độ ẩm, hàm lượng tro bằng phương pháp trọng

lượng.

3

+ Xác định hàm lượng kim loại nặng bằng phương pháp

quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS).

- Chiết tách các chất trong cây cỏ sữa lá nhỏ bằng phương

pháp ngâm lạnh, phương pháp chiết nóng với dung môi ethanol –

nước.

- Xác định các nhóm hoạt chất trong các dịch chiết bằng các

phản ứng hóa học đặc trưng theo qui trình phân tích thành phần hóa

thực vật của bộ môn Dược liệu, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí

Minh.

- Thử tác dụng hạ đường huyết trên chuột của dịch chiết cỏ

sữa lá nhỏ.

- Chiết tách, phân lập, tinh chế các chất trong cây cỏ sữa lá

nhỏ bằng phương pháp chiết phân phân đoạn với các dung môi và sắc

ký cột.

- Xác định thành phần hóa học các chất dễ bay hơi trong dịch

chiết của các phân đoạn bằng sắc ký khí ghép khối phổ GC – MS.

- Xác định cấu trúc hóa học của chất tinh chế được bằng

phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), phổ khối lượng

(MS).

4.3. Xử lý số liệu

- Các số liệu được xử lý theo phương pháp thống kê, sử dụng

excel 2007.

5. Bố cục đề tài

Ngoài phần mở đầu (3 trang), kết luận và kiến nghị (2 trang),

tài liệu tham khảo (5 trang), luận văn gồm 16 bảng, 6 hình và 4

chương như sau:

Chương 1: Tổng quan (17 trang)

Chương 2: Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu (8 trang)

Chương 3: Kết quả và thảo luận (23 trang)

4

CHƢƠNG 1

TỔNG QUAN

1.1. VÀI NÉT VỀ ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ PHÂN BỐ CÂY

CỎ SỮA LÁ NHỎ

1.2. THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CỎ SỮA LÁ NHỎ

1.2.1. Nghiên cứu ở Việt Nam

1.2.2. Nghiên cứu trên thế giới

1.3. NGHIÊN CỨU VỀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CỎ SỮA

LÁ NHỎ

1.3.1. Tác dụng hạ đƣờng huyết

1.3.2. Tác dụng giảm đau

1.3.3. Tác dụng kháng khuẩn, kháng virus, kháng nấm,

kháng sinh, kháng viêm

1.3.4. Tác dụng chống oxy hóa, gốc tự do

1.3.5. Tác dụng trị giun

1.3.6. Tác dụng lợi tiểu, nhuận tràng

1.4. CÔNG DỤNG CỦA CỎ SỮA LÁ NHỎ

1.5. MỘT SỐ DƢỢC LIỆU CÓ TÁC DỤNG HẠ ĐƢỜNG

HUYẾT

CHƢƠNG 2

NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1.1. Nguyên liệu

Nguyên liệu nghiên cứu là toàn cây Cỏ sữa lá nhỏ

(Euphorbia thymifolia L.) được thu hái ở khu vực huyện Thăng Bình

– Quảng Nam vào tháng 05 năm 2016.

5

Hình 2.1. Cỏ sữa lá nhỏ đã xử lý

2.1.2. Hoá chất – dung môi, thiết bị

2.1.3. Động vật thí nghiệm

2.1.4. Địa điểm nghiên cứu

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Xác định các thông số hoá lý

a. Xác định độ ẩm

b. Xác định hàm lượng tro bằng phương pháp tro hóa mẫu

c. Xác định hàm lượng một số kim loại nặng bằng phương

pháp hấp thụ nguyên tử (AAS)

2.2.2. Nghiên cứu thành phần hoá học

2.2.3. Nghiên cứu tác dụng hạ đƣờng huyết

2.3. PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU

CHƢƠNG 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CÁC THÔNG SỐ HOÁ LÝ

3.1.1. Độ ẩm

Độ ẩm trung bình của mẫu nguyên liệu cỏ sữa lá nhỏ xác

định được là 9,64 .

6

3.1.2. Độ tro toàn phần

Độ tro toàn phần trung bình của mẫu nguyên liệu cỏ sữa lá

nhỏ xác định được là 7,82%.

3.1.3. Hàm lƣợng kim loại nặng

Bảng 3.3. Hàm lượng kim loại nặng trong mẫu cỏ sữa lá nhỏ

STT

Chỉ

tiêu

Kết quả mg g

Hàm lƣợng

cho ph p

(mg/kg)

1 Hg Không phát hiện (< 0,05) 0,050

2 As 0,18 1,000

3 Pb Không phát hiện (< 0,1) 2,000

4 Cd 0,96 1,000

3.2. KẾT QUẢ THỬ TÁC DỤNG HẠ ĐƢỜNG HUYẾT CỦA CÂY

CỎ SỮA LÁ NHỎ

3.2.1. Kết quả chiết xuất dƣợc liệu

Toàn cây cỏ sữa lá nhỏ được rửa sạch, thái nhỏ, phơi và sấy

khô ở 60

0C. Lấy 0,5 kg mẫu ngâm chiết với 2,5 lít ethanol 96% 3 lần,

sau đó gộp các dịch chiết, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm đến

khi được cao 5:1 thu được cao chiết ET1. Tiến hành tương tự với các

dung môi ethanol 80 , ethanol 50 thu được cao chiết ET2, ET3.

Lấy 0,5 kg mẫu chiết nóng với 2,5 lít nước cất 3 lần, sau đó

gộp các dịch chiết, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm đến khi

được cao 5:1 thu được cao chiết ET4.

Cân khối lượng các cao chiết thu được, từ đó tính hiệu suất

chiết của các dung môi.

7

Bảng 3.4. Kết quả hiệu suất chiết cỏ sữa lá nhỏ trong dung môi

EtOH/H2O

STT Dung

môi

Khối

lƣợng

dƣợc

liệu g

Khối

lƣợng

cao chiết

(g)

Hàm

lƣợng

cao chiết

(%)

Hàm

lƣợng cao

chiết

trung

bình (%)

1 Ethanol

96% 500

23,5 4,7

4,71

23,4 4,68

23,7 4,74

2 Ethanol

80% 500

24,0 4,8

4,8 24,1 4,82

23,9 4,78

3 Ethanol

50% 500

24,4 4,88

4,91

24,5 4,9

24,7 4,94

4

Nước

cất

500

25,2 5,04

5,03 25,1 5,02

25,2 5,04

Nhận x t: Kết quả Bảng 3.4 cho thấy hiệu suất chiết xuất các

hợp chất từ cây cỏ sữa lá nhỏ rất thấp và hiệu suất chiết tỉ lệ thuận

với độ phân cực của dung môi chiết.

3.2.2. Kết quả thử tác dụng hạ đƣờng huyết của cỏ sữa lá nhỏ

Chia chuột thành các lô gồm: 1 lô chứng trắng; 1 lô chứng

dương; 4 lô thử (uống hỗn dịch cao chiết dược liệu với liều 6g/kg của

4 mẫu cao chiết ET1, ET2, ET3 và ET4). So sánh sự thay đổi đường

huyết của các lô sau thời gian điều trị, kết quả trình bày ở bảng 3.5.

8

Bảng 3.5. Sự thay đổi đường huyết của các lô chuột uống

Euphorbia thymifolia L

Lô

Đƣờng huyết

(mmol/l)

Tỷ lệ hạ

đƣờng

huyết %

p so với lô

Ngày 0 Ngày 7 1 2

1

Chứng

trắng 15,41,1 15,11,2 2,560,99

2

Chứng

dương 16,61,8 9,60,9 41,731,85 p2,1<0,001

3 ET1 14,61,6 10,00,7 28,042,77 p3,1<0,001 p3,2<0,001

4 ET2 14,21,6 10,21,0 30,331,25 P4,1<0,001 P4,2<0,001

5 ET3 14,81,2 10,50,9 32,801,94 p5,1<0,001 P5,2<0,001

6 ET4 14,90,7 10,50,7 25,001,36 p6,1<0,001 P6,2<0,001

Nhận x t: Kết quả Bảng 3.5 cho thấy các mẫu Euphorbia

thymifolia L. đều có tác dụng làm tăng tỉ lệ hạ đường huyết so với lô

chứng trắng (p < 0,001). Tác dụng hạ đường huyết cao nhất là của

mẫu ET3 (32,8 ). So với lô chứng dương, mức hạ đường huyết của

các lô mẫu thử thấp hơn (p < 0,001).

3.3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC

3.3.1. Định tính các nhóm chất hữu cơ trong cây cỏ sữa lá nhỏ

Bảng 3.6. Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong cây cỏ

sữa lá nhỏ

STT

Nhóm hợp

chất

Phản ứng định tính

Kết

quả

Kết

luận

1 Flavonoid Phản ứng Cyanidin

Phản ứng với:

Dung dịch NaOH 10%

Dung dịch FeCl3 5%

+++

+++

+++

Có

2 Alcaloid

Phản ứng với thuốc thử:

Mayer

Bouchardat

-

-

Không

có

9

STT

Nhóm hợp

chất

Phản ứng định tính

Kết

quả

Kết

luận

Dragendorff -

3 Saponin

Phản ứng với H2SO4 đậm

đặc

Hiện tượng tạo bọt

++

++

Có

4 Anthranoid Phản ứng Borntraeger ++ Có

5 Tannin

Phản ứng với:

Dung dịch Gelantin 1%

Dung dịch FeCl3 5%

++

+++

Có

6 Đường khử

Phản ứng với thuốc thử

Fehling A + Fehling B

++ Có

7 Carotenoid Phản ứng với H2SO4 đậm

đặc

++ Có

8 Phytosterol Phản ứng Lieberman ++ Có

9 Chất béo Để lại vết mờ trên giấy lọc + Có

10 Acid hữu cơ

Phản ứng với Na2CO3 tinh

thể

-

Không

có

11 Coumarin

Phản ứng đóng mở vòng

lacton

-

Không

có

12 Tinh dầu Mùi thơm + Có

13 Glycosid tim

Phản ứng Libermann

Phản ứng Baljet

Phản ứng Legal

Phản ứng Keller-kiliani

-

-

-

-

Không

có

14 Acid amin Thuốc thử Ninhydrin 0,1% + Có

Ghi chú: (-): Phản ứng âm tính. (+): Phản ứng dương tính.

(++): Phản ứng rõ. (+++): Phản ứng rất rõ

10

3.3.2. Kết quả định tính flavonoid trong cắn phân đoạn

chiết bằng phản ứng hoá học

Lấy khoảng 500g nguyên liệu, chiết bằng phương pháp ngâm

lạnh dùng dung môi ethanol 50%. Dịch chiết thu được đem lọc và cất

thu hồi dung môi ethanol ở áp suất giảm đến cao. Cao thu được phân tán

vào 1000 ml nước và tiến hành chiết lần lượt bằng các dung môi có độ

phân cực tăng dần n-hexane, CH2Cl2, EtOAc. Cô thu hồi dung môi các

dịch chiết thu được dưới áp suất giảm thu được các cao n-hexane, cao

CH2Cl2, cao EtOAc và cao nước. Hoà tan các cao bằng ethanol 96%.

- Kết quả định tính flavonoid:

Bảng 3.7. Kết quả định tính flavonoid trong cao các

phân đoạn chiết

Phản ứng định tính

Cao

n-hexane CH2Cl2 EtOAc Nƣớc

Với thuốc thử Cyanidin - + +++ +

Với NaOH 10% - ++ +++ ++

Với hơi ammoniac - + +++ +

Với FeCl3 5% - ++ +++ ++

Kết quả Không có Có Có Có

Nhận xét: Kết quả định tính ở Bảng 3.7 cho thấy cao CH2Cl2,

EtOAc, nước đều có flavonoid, cao EtOAc cho phản ứng rõ nhất.

3.3.3. Xác định thành phần hoá học các chất dễ bay hơi

của cỏ sữa lá nhỏ trong các dung môi hữu cơ

Toàn cây cỏ sữa lá nhỏ được rửa sạch, thái nhỏ, phơi và sấy

khô ở 500C. Lấy 1 kg mẫu ngâm chiết với 5 lít ethanol 50% 3 lần, sau

đó gộp các dịch chiết lại, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm được

46g cao đậm đặc. Phân tán cao đậm đặc này vào 1 lít nước cất rồi tiến

hành chiết lần lượt bằng n-hexane, CH2Cl2 và EtOAc với 1 lít mỗi