Nghiên cứu chiết tách hoạt chất từ cây ruốc cá ứng dụng làm thuốc trừ sâu

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

NGUYỄN THỊ VIỄN TƢỞNG

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH HOẠT CHẤT

TỪ CÂY RUỐC CÁ ỨNG DỤNG LÀM

THUỐC TRỪ SÂU

CHUYÊN NGÀNH: HÓA HỮU CƠ

MÃ SỐ: 88 44 01 14

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÓA HỌC

ĐÀ NẴNG, NĂM 2018

Công trình đƣợc hoàn thành tại

Trƣờng Đại học Sƣ phạm- ĐHĐN

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:

TS. NGÔ MINH ĐỨC

TS. ĐOÀN THỊ VÂN

Phản biện 1:

...............................................................................................

Phản biện 2:

...............................................................................................

Luận văn sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm Luận văn

tốt nghiệp thạc sĩ Hóa hữu cơ họp tại Trường Đại học Sư phạm￾ĐHĐN vào ngày ...... tháng...... năm.......

Có thể tìm hiểu luận văn tại:

- Trung tâm Thông tin- Học liệu, Đại học Đà Nẵng

- Thư viện trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng

1

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài

Các loại thuốc trừ sâu hiện nay chúng ta sử dụng cho nền nông

nghiệp nước nhà chủ yếu nhập khẩu từ nước ngoài. Nghiên cứu cho

thấy, trong tám tháng đầu năm 2017 với giá trị nhập khẩu đạt 662

triệu USD, tăng 47% so với cùng kỳ năm 2016. Các xí nghiệp của ta

chỉ vào bao bì, gắn nhãn mác và tiêu thụ. Điều đáng báo động việc

con người lạm dụng thuốc trừ sâu gây dẫn đến hậu quả chúng ta

không thể ngờ tới.

Đối với con người, hơn 260 nghiên cứu trên toàn thế giới đã

tiến hành khảo sát tác hại của thuốc trừ sâu cho thấy, chúng đều liên

quan đến một số loại ung thư như ung thư vú, tuyến tiền liệt, não,

xương, tuyến giáp, đại tràng, gan, phổi.. Ngoài ra, phụ nữ đang mang

thai hoặc đang cho con bú tiêu thụ phải thuốc trừ sâu có thể làm tăng

nguy cơ ung thư não ở thai nhi, hay sẽ ảnh hưởng đến khả năng học

tập, hành vi, nhận thức của trẻ sau này.

Đối với môi trường, loại thuốc tổng hợp này có lưu bã độc lâu

dài ảnh hưởng rất nhiều đến sinh thái môi trường. Ví dụ như thuốc

Malathion, một loại thuốc dùng để diệt sâu nách, sâu đất, sau khi

phun thuốc ba tháng, lưu bã độc cũng còn khoảng 40%.

Ở các nước tiên tiến như Mỹ, Nhật, Đức, Pháp…hầu hết thuốc

trừ sâu sử dụng đều có nguồn gốc từ thảo mộc.

Các loại thuốc trừ sâu có nguồn gốc từ thảo mộc mặc dù có tác

dụng chậm với sâu bọ nhưng không có lưu bã độc lâu dài và càng

không gây độc cho người trực tiếp tiếp xúc với nó cũng như người

tiêu dùng. Chính vì vậy, thuốc trừ sâu sinh học có nguồn gốc từ thảo

2

mộc rất được ưa chuộng trên thế giới. Ở ngoài không khí, dưới tác

dụng tia tử ngoại của ánh sáng mặt trời, hoạt chất của thuốc trừ sâu

gốc thảo mộc chỉ thường tồn tại tối đa 72 giờ.

Mục tiêu của đề tài là nhằm nghiên cứu thuốc trừ sâu sinh học

có nguồn gốc từ thảo mộc, mà cụ thể là từ cây ruốc cá, nguồn nguyên

liệu trong nước để phục vụ cho nông nghiệp nước ta.

Từ năm 1910, người Trung Quốc đã biết sử dụng rễ cây ruốc

cá để làm thuốc trừ sâu. Năm 1912, Nagai trích ra được từ cây ruốc

cá Derris chinensis mọc ở Đài Loan mà dân bả xứ gọi là “gyoto”,

một hoạt chất có nhiệt độ nóng chảy 163oC và ông đặt tên là

rotenone vì nó có tính chất của một xeton. Năm 1916, Ishikawa trích

được từ cây Derris elliptica, một hợp chất có cùng nhiệt độ nóng

chảy và đặt tên là tubotoxin, nhưng đến năm 1923 Kariyone và Kodo

xác nhận hai hợp chất rotenone và tubotoxin giống nhau.

Đến năm 1928, Takei và Koide đề nghị công thức nguyên của

rotenone là C23H22O6 và đến năm 1932 công thức của rotenone được

xác định.

Từ đó đến nay, nhiều nhà hóa học đã nghiên cứu chiết tách các

hoạt chất trong cây ruốc cá, gọi tên chung là rotenoid và cũng từ đó,

cây ruốc cá được sử dụng rộng rãi trên thế giới làm thuốc trừ sâu.

Hoạt chất trong cây ruốc cá cực độc với cá và độc với côn

trùng. Nhưng đối với người và động vật máu nóng các chất đó hầu

như không có độc tính (qua đường tiêu hóa). Đó chính là lí do tôi

chọn đề tài: “ Điều chế thuốc trừ sâu sinh học từ cây ruốc cá”.

2. Đối tƣợng và mục đích nghiên cứu

2.1. Đối tượng nghiên cứu

- Cây ruốc cá tại huyện Nông Sơn, tình Quảng Nam.

3

2.2. Mục đích nghiên cứu

- Điều chế thuốc trừ sâu sinh học.

- Tìm ra được hoạt tính của thuốc có tác dụng tốt nhất đối với

loại bệnh nào cho cây, và phạm vi cây trồng sẽ sử dụng.

3. Phƣơng pháp nghiên cứu

3.1. Phương pháp nghiên cứu lý thuyết

- Thu thập, phân tích các tài liệu về hoạt tính của rotenone đối

với các chủng vi sinh vật gây bệnh cho cây trồng, rau xanh, cây nông

nghiệp.

3.2. Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

- Phần hóa học: Điều chế thuốc trừ sâu từ cây ruốc cá, tiến hành

khảo sát phân lập thành phần hóa học dịch chiết của cây ruốc cá.

- Phần sinh học: Xác định chủng vi khuẩn cần đối kháng, tiến

hành đối kháng trên chủng vi khuẩn đã có, đánh giá chế phẩm.

4. Bố cục đề tài

Ngoài phần mở đầu, danh mục các Bảng, Hình, đồ thị, sơ đồ,

kết luận và kiến nghị, tài liệu tham khảo. Trong luận văn được chia

làm các chương sau:

Chương 1: Tổng quan

Chương 2: Phương pháp và đối tượng nghiên cứu

Chương 3: Kết quả và bàn luận

4

CHƢƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. TỔNG QUAN VỀ CHI RUỐC CÁ

1.1.1. Danh pháp và phân loại

Cây ruốc cá (danh pháp khoa học: Derris) là một chi chứa các

loài dây leo thuộc họ Đậu, sinh sống chủ yếu trong khu vực Đông

Nam Á và các đảo tây nam Thái Bình Dương, bao gồm cả New

Guinea.

1.1.2. Hình thái học

Cây ruốc cá là một loại dây leo khoẻ thân dài 7-10m, lá kép

gồm 9-13 lá chét, mọc so le, dài 25-35cm, lá chét lúc đầu mỏng, sau

dai dày, hình mác, đầu nhọn, phía dưới tròn.

Hoa nhỏ, đài hoa màu hồng, cánh hoa màu trắng hay hồng.

1.1.3. Sinh thái học và phân bố

Các vùng trồng nhiều cây ruốc cá gồm có: Ấn Độ, miền nam

Trung Quốc, Malaysia, Indonesia, Philippines, Việt Nam, New

Guinea, châu Phi và Mỹ

1.1.4. Thành phần hóa học

a. Rotenon : Rotenone là hoạt chất chủ yếu trong cây, có công

thức nguyên là C23H32O6, M=394,41, có dạng tinh thể đơn tà sáu mặt,

không màu, kết tinh trong tricloroetilen.

b. Deguelin: Deguelin có công thức nguyên C23H32O6,

M=349,41, cũng là một rotenoid có tác dụng trừ sâu trong cây Derris

elliptica Benth.

c. Tephrosin: Tephrosin có công thức nguyên C23H22O7,

M=410,41, cũng là thành phần rotenoid trong cây Derris elliptica

Benth. Tephrosin kết tinh dưới dạng tinh thể hình lăng trụ; m.p:

5

1980C, tan trong chloroform,eter, aceton, ít tan trong methanol,

không tan trong nước.

d. Sumatrol: Sumatrol có công thức nguyên C23H22O7,

M=410,41, cũng là một thành phần rotenoid trong cây ruốc cá

e. Toxicarol: Toxicarol có dạng tinh thể hình lục lăng màu

vàng lục; m.p: 2190C; toxicarol và sumatrol đều có cùng công thức

nguyên là C23H22O7 và đều có nhóm OH ở vị trí 5 đối với sumatrol

và ở vị trí 6 đối với toxicarol.

1.1.5. Công dụng và bộ phận dùng

a.T ác dụng dược lí: Từ lâu đời, được nhân dân vùng Đông

Nam Châu Á dùng ruốc cá: nghiền rễ với nước với 1 phần triệu cá bị

say và người ta bắt cá dễ dàng. Với liều cao hơn cá có thể bị chết.

b. Công dụng và liều dùng: Đối với người và gia súc: người

ta dùng rễ ruốc cá làm thuốc tẩy giun, nhưng rễ cây ruốc cá cũng ít

dùng so với các loại thuốc giun khác. Ngoài ra còn dùng chữa ghẻ

dưới dạng thuốc mỡ.

1.1.6. Tình hình nghiên cứu cây ruốc cá

a. Trên thế giới

- Năm 1934, M. C. Swingle cho thấy cách tác dụng khác nhau

của bột cây Derris elliptica Benth và của bột cây Pyrethrum trên sâu

cải bắp. Rotenon và pyrethrin lần lượt là độc chất tác dụng qua

đường tiêu hóa và đường tiếp xúc khi thử nghiệm với đĩa phim chứa

gelanin với bột Derris hay bột Pyrethrum có 0,7% rotenone (hay

pyrethrin) trên ấu trùng Ascia rapac.

b. Tại Việt Nam

Đề tài do các tác giả Phạm Thanh Kỳ (Trường ĐH Dược Hà

Nội), Nguyễn Trọng Đường, Nguyễn Hoành Côi (Trung tâm KNNC

6

Dược Quân đội), Chu Đình Kính (Viện Hoá học - Viện Khoa học và

Công nghệ Việt Nam) thực hiện nghiên cứu về thành phần hoá học,

độc tính và một số tác dụng sinh học, thông báo kết quả phân lập và

xác định cấu trúc rotenon trong rễ cây dây mật (Milletia pachyloba

Drake var. pachyloba) tiến hành vào tháng 5/2007.

1.2. TỔNG QUAN VỀ CÁC CHỦNG VI SINH VẬT VÀ NẤM

SỬ DỤNG ĐỂ KIỂM TRA HOẠT TÍNH SINH HỌC

1.2.1. Tổng quan về các chủng vi sinh vật và nấm dùng để

kiểm tra hoạt tính sinh học

a. Salmonella: Salmonella thuộc họ Enterobacteriaceae (vi

khuẩn đường ruột) là một giống vi khuẩn hình que, trực khuẩn gram

âm, kị khí tùy nghi không tạo bào tử, di động bằng tiên mao, sinh

sống trong đường ruột, có đường kính khoảng 0,7 µm đến 1,5 µm,

dài từ 2 µm đến 5 µm và có vành lông rung hình roi.

b. Escherichia Coli: E.coli là trực khuẩn Gram âm. Kích

thước trung bình từ 2 đến 3µm x 0,5µm;trong những điều kiện không

thích hợp (ví dụ như trong môi trường có kháng sinh) vi khuẩn có thể

rất dài như sợi chỉ. Rất ít chủng E.coli có vỏ, nhưng hầu hết có lông

và có khả năng di động.

c. Pseudomonas: Đặc điểm hình thái học chung cho

Pseudomonas là Gram âm, tế bào hình que, di động nhờ roi ở đầu và

không có bào tử.

d. Streptococcus: Liên cầu là những cầu khuẩn bắt màu Gram

dương, đường kính khoảng 0,6- 0,8 μm, xếp liên tiếp với nhau thành

từng chuỗi, dài ngắn khác nhau và có thể đứng với nhau thành từng

đôi hoặc từng đám.

e. Nấm bệnh Fusarium: Fusarium là chi lớn nhất trong

7

Tuberculariaceae, chúng hoại sinh hoặc ký sinh trên nhiều cây trồng,

cây ăn trái và rau. Nó là nguyên nhân chính làm héo rũ cây chủ. Hệ

sợi nấm lan toả khắp mô mạch và lấp kín mạch gỗ.

1.2.2. Tổng quan về phƣơng pháp nuôi cấy các chủng vi

sinh vật và nấm để kiểm tra hoạt tính sinh học

a. Salmonella

b. Escherichia Coli

c. Pseudomonas

d. Streptococcus

e. Nấm Fusarium

1.2.3. Tổng quan về phƣơng pháp đối kháng bệnh

- Đối với các chủng vi khuẩn:

Dịch lắc của vi khuẩn kiểm định được cấy trải trên các đĩa môi

trường LB - thạch với thể tích 100 μl. Các lỗ được đục với đường

kính 6mm trên các đĩa thạch.

Dịch lọc của từng chủng vi sinh vật thử nghiệm được cho vào các lỗ

thạch với thể tích 30 μl. Các đĩa thạch được ủ qua đêm ở 370C. Quan

sát và chụp ảnh trên các đĩa thạch.

8

CHƢƠNG 2

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ

2.1.1. Nguyên liệu

a. Thu gom nguyên liệu

b. Xử lí nguyên liệu

2.1.2. Hóa chất

2.1.3. Thiết bị

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Khảo sát hoạt tính sinh hoạt các bộ phận của cây

ruốc cá

2.2.2. Phƣơng pháp chiết mẫu thực vật

Mẫu thực vật thường được chiết theo hai cách:

Cách thứ nhất: Chiết mẫu với dung môi là MeOH

Cách thứ hai: Mẫu thực vật khô được chiết lần lượt với từng

loại dung môi n–hexan, EtOAc và MeOH.

2.3. THỰC NGHIỆM

2.3.1. Khảo sát hoạt tính sinh hoạt các bộ phận của cây

ruốc cá

Khảo sát hoạt tính vi sinh vật kiểm định bằng định tính theo

phương pháp khuyếch tán trên thạch tiêu chuẩn tại phòng thử hoạt

tính sinh học – Khoa Sinh, trường Đại Học Sư Phạm Đà Nẵng.

Các chủng vi sinh vật thử gồm:

- Vi khuẩn Gram (+): Streptococcus.

- Vi khuẩn Gram (-):Salmonella enterica, Pseudomonas

aeruginosa, Escherichia Coli.

9

- Nấm: Fusarium

2.3.2. Phƣơng pháp chiết mẫu thực vật

Lấy 15 gam bột rễ cây ruốc cá, cho vào túi vải lọc trắng. Chiết

soxhlet lần lượt với các dung môi hexane, ethyl acetat, chloroform,

methanol. Mỗi dung môi chiết trong 12 giờ và thu được dịch chiết.

2.3.3. Phƣơng pháp tách và tinh chế chất

a. Điều chế các cao chiết

Lấy 3 kg bột rễ cây ruốc cá, ngâm với 20 lít dung dịch

methanol trong 3 lần, mỗi lần 24 giờ.

Dịch chiết được lọc qua giấy lọc, rồi đem cất quay chân không

dưới áp suất thấp để đuổi bớt dung môi. Phần dung môi thu được sau

cô quay tận dụng để chiết tiếp lần sau. Sau đó, đuổi hết dung môi thu

được 100g cao methanol.

Hòa cao methanol với khoảng 50 mL nước cất rồi chiết phân

đoạn bằng phễu chiết lần lượt với hexane, chloroform và ethyl acetat

(mỗi dung môi 3 lần, mỗi lần 600 mL). Cặn từ dịch chiết hexane

(44g), chloroform (26g), ethyl acetat (18,1g).

b. Chạy cột sắc kí phần cao chloroform

 Chuẩn bị cột sắc kí

 Chuẩn bị cột sắc kí

 Nạp mẫu vào cột

Nạp mẫu lên cột silicagel, sau đó xả cột thu được 6 phân đoạn.

Phân đoạn C.9.4 (0,72g) sau khi được bay hơi tự nhiên tiếp tục tách

chất trên cột silicagel với dung môi chạy cột là n-hexan/EtOAc

(1:2,5), sau đó xả cột thu được 5 phân đoạn.

Ở phân đoạn C.9.4.3 (0,07g), chấm bản mỏng với hệ dung môi

n-hexan/EtOAc(1:2,5) thì thấy chỉ xuất hiện 1 vệt, chiếu đèn UV và

10

hiện thuốc thử H2SO4 10% chỉ cuất hiện một màu vàng nhạt. Chất

này được kí hiệu là NEW 1.

2.4. CÁC PHƢƠNG PHÁP SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU

Sau khi thực hiện xong thí nghiệm, các mẫu sản phẩm đã

được làm sạch, khảo sát các hoạt tính sinh học, xác định cấu trúc hóa

học…bằng các phương pháp: Sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng, phổ khối

lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H- NMR; 13C- NMR).

2.4.1. Sắc ký cột

2.4.2. Sắc ký lớp mỏng

2.4.3. Phổ khối lƣợng (MS)

2.4.4. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR)

a. Phổ

1H-NMR

b. Phổ

13C-NMR

c. Phổ DEPT

d. Phổ 2D-NMR