Nghiên cứu chiết tách các chất có hoạt tính kháng u và điều biến miễn dịch từ hai loài nấm hầu thủ (Hericium erinaceus) và nấm hương (Lentinula edodes) nuôi trồng ở Việt Nam

i

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM

KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

----------------

TRẦN THỊ HỒNG HÀ

NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH CÁC CHẤT CÓ HOẠT TÍNH

KHÁNG U VÀ ĐIỀU BIẾN MIỄN DỊCH TỪ HAI LOÀI NẤM HẦU

THỦ (Hericium erinaceus) VÀ NẤM HƯƠNG (Lentinula edodes)

NUÔI TRỒNG Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành: Hoá học các hợp chất thiên nhiên

Mã số: 62.44.01.17

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

HÀ NỘI, 2015

ii

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Kí hiệu Tiếng anh Tiếng việt

AST Serum aspartat transaminase

ALT Serum alanin transaminase

ATCC American Type Culture

Collection

Ngân hàng chủng giống Mỹ

BC Bạch cầu

BSA Bovine serum albumin Albumin huyết thanh bò

13C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic

Resonance Spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

carbon 13

CC Column Chromatography Sắc kí cột

CCT Chuột cống trắng

CNT Chuột nhắt trắng

COSY Correlation Spectroscopy Phổ COSY

CS% Cell survival % % tế bào sống sót

DEPT Distortionless Enhancement by

Polarisation Transfer

Phổ DEPT

DEAE￾cellulose

cellulose Diethylaminoethyl

DMSO Dimethyl sulfoxid Dimetyl sulfoxit

EAC Ehrlich ascites Carcinoma Ung thư cổ trướng

ECACC The European Collection of Cell

Cultures

Ngân hàng chủng giống châu

Âu

ESI-MS Electron Spray Ionization Mass

Spectra

Phổ khối ion hóa phun mù

điện tử

EtOAc Ethyl acetate Etyl axetat

FBS Foetal bovine serum Huyết thanh bào thai bò

Fl Human cervical uterine carcinoma Tế bào Ung thư tử cung

GC Gas Chromatography Sắc kí khí

iii

γGT Serum gamma glutanin

transaminase

Hb Haemoglobin

HC Hồng cầu

Hep-G2 Hepatocellular carcinoma Tế bào ung thư gan người

HMBC Heteronuclear Multiple Bond

Connectivity

Phổ tương tác dị hạt nhân qua

nhiều liên kết

1H-NMR Proton Nuclear Magnetic

Resonance Spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

proton

HPLC High Performance liquid

Chromatography

Sắc kí lỏng cao áp hiệu năng

cao

HSQC Heteronuclear single-Quantum

Conherence

Phổ tương tác dị hạt nhân qua

một liên kết

IC50 Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế 50%

KLT Khối lượng tạng

KN Kháng nguyên

LD50 lethal dose 50% Liều gây chết 50% động vật

thực nghiệm

Lu Human lung adenocarcinoma Tế bào Ung thư biểu mô phổi

MIC minimum inhibitory concentration Nồng độ ức chế tối thiểu

NC Nghiên cứu

OD Optical Density Mật độ quang

OVA Ovalbumin Albumin lòng trắng trứng

PBS Phosphat buffer saline Dung dịch đệm phosphat

RD Human Rhabdomyosarcoma Ung thư mô liên kết

SC% % scavenging capacity % khả năng trung hòa gốc tự

do

SGMD Suy giảm miễn dịch

SRB Sulforhodamine B

TCA Trichloacetic acid Axit tricloaxetic

TCCS Tiêu chuẩn cơ sở

iv

TCL Thin Layer Chromatography Sắc kí lớp mỏng

TL (g) Trọng lượng (gam)

TLCT Trọng lượng cơ thể

TNFα Tumor necrosis factor Yếu tố hoại tử ung thư

VSV Vi sinh vật

WHO World Health Organization Tổ chức Y tế thế giới

v

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT.............................................. ii

DANH MỤC SƠ ĐỒ VÀ HÌNH......................................................................... xiii

MỞ ĐẦU .................................................................................................................1

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU..................................................................3

1.1. Nấm dược liệu và ứng dụng trong y học dân tộc ............................................3

1.1.1. Giới thiệu về nấm dược liệu........................................................................3

1.1.2. Ứng dụng trong y học dân tộc.....................................................................4

1.2. Những nghiên cứu trên thế giới về các chất có hoạt tính sinh học của nấm

dược liệu ..................................................................................................................6

1.2.1. Các hợp chất có phân tử lượng nhỏ ............................................................6

1.2.1.2. Các chất có hoạt tính sinh học khác .........................................................11

1.2.2. Hoạt tính của polysaccharide từ nấm dược liệu .........................................19

1.3. Tình hình nghiên cứu về nấm hầu thủ và nấm hương...................................30

1.3.1. Nấm hầu thủ (Hericium erinaceus) ..........................................................30

1.3.1.1. Trên thế giới...........................................................................................30

1.3.1.2. Ở Việt Nam............................................................................................34

1.3.2. Nấm hương (Lentinus edodes)..................................................................35

1.3.2.1. Trên thế giới...........................................................................................36

1.3.2.2. Ở Việt Nam...........................................................................................40

1.4. Mô hình nuôi cấy tế bào ung thư ba chiều (3D) trong nghiên cứu ung thư...41

CHƯƠNG II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...............44

2.1. Đối tượng nghiên cứu....................................................................................44

2.1.1. Nấm hương................................................................................................44

2.1.2. Nấm hầu thủ..............................................................................................44

2.2. Dụng cụ, hóa chất và môi trường ..................................................................44

2.2.1. Dụng cụ và thiết bị....................................................................................44

2.2.2. Môi trường ................................................................................................44

2.3. Các phương pháp phân lập các hợp chất.......................................................45

vi

2.4. Phương pháp tinh sạch β-glucan từ nấm hương và nấm hầu thủ ...................46

2.4.1. Phương pháp tinh sạch β-1,3-glucan từ nấm hương....................................46

2.4.2. Phương pháp tinh sạch β-1,3-glucan từ nấm hầu thủ..................................46

2.5. Các phương pháp xác định cấu trúc hoá học..................................................46

2.6. Phương pháp xác định hàm lượng polysaccharide.........................................46

2.7. Phương pháp thủy phân không hoàn toàn β-1,3-glucan từ nấm hầu thủ bằng

-1,3-glucanase......................................................................................................47

2.8. Nghiên cứu bao curcumin (Cur) bằng β-1,3/1,6-glucan ................................47

2.9. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học.......................................................48

2.9.1. Phương pháp thử khả năng gây độc tế bào (cytotoxicity)...........................48

2.9.2. Phương pháp ức chế hình thành khối u 3 chiều trên thạch mềm (anti-tumor

promoting assay) in vitro.......................................................................................50

2.10. Các phương pháp thử dược lý ......................................................................51

2.10.1. Phương pháp đánh giá độc tính cấp...........................................................51

2.10.2. Phương pháp đánh giá độc tính bán trường diễn......................................51

2.10.3. Phương pháp đánh giá một số tác dụng của sản phẩm..............................52

2.10.3.1. Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của HG1 trên mô hình gây độc gan

bằng carbon tetracholorid ......................................................................................52

2.10.3.2. Nghiên cứu tác dụng của HG1 đến quá trình tổng hợp protein trên động

vật khi dùng bán trường diễn.................................................................................52

2.10.3.3. Nghiên cứu tác dụng trên hệ miễn dịch của HG1 thực nghiệm .............52

2.10.3.4. Phương pháp thử hiệu lực kháng u thực nghiệm....................................52

2.10.4. Xử lý số liệu...............................................................................................52

CHƯƠNG III. THỰC NGHIỆM...........................................................................53

3.1. Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của nấm hương............................53

3.1.1. Phân lập các hợp chất từ quả thể nấm hương.............................................53

3.1.2. Tách polysaccharide từ dịch lên men nấm hương......................................55

3.1.3. Các hằng số vật lý và số liệu phổ của các hợp chất đã phân lập từ nấm

hương 55

vii

3.1.4. Tinh sạch β-1,3/1,6 glucan (lentinan) từ nấm hương (sơ đồ 3.3)................56

3.2. Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của nấm hầu thủ ..........................57

3.2.1. Phân lập các hợp chất từ quả thể nấm hầu thủ (sơ đồ 3.4)..........................57

3.2.2. Tách polysaccharide từ dịch lên men nấm hầu thủ ....................................60

3.2.3. Các hằng số vật lý và số liệu phổ của các hợp chất đã phân lập từ nấm hầu

thủ 60

3.2.4. Tinh sạch β-1,3/1,6 glucan từ nấm hầu thủ .................................................61

3.2.5. Thủy phân không hoàn toàn β-1,3-glucan từ nấm hầu thủ bằng enzyme -

1,3-glucanase .........................................................................................................62

3.2.6. Sử dụng β-1,3/1,6-glucan từ nấm hầu thủ làm chất mang curcumin ..........64

3.3. Tạo chế phẩm thử nghiệm ..............................................................................66

3.4. Thử dược lý chế phẩm....................................................................................66

3.4.1. Nghiên cứu độc tính cấp..............................................................................66

3.4.3. Nghiên cứu một số tác dụng của sản phẩm HG1 trên động vật thực nghiệm

……………………………………………………………………………………68

3.4.4. Nghiên cứu thử hiệu lực kháng u thực nghiệm trên động vật của sản phẩm

HG2….…………………………………………………………………………...70

CHƯƠNG IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN......................................................73

4.1. Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của nấm hương............................73

4.1.1. Tách các phân đoạn và đánh giá hoạt tính sinh học ...................................73

4.1.2. Xác định cấu trúc các hợp chất NH1, NH2 và NH3.................................76

4.1.2.1. Hợp chất NH1: galactiol ........................................................................76

4.1.2.2. Hợp chất NH-2: Ergosterol....................................................................80

4.1.2.3. Hợp chất NH3: Ergosterol peroxide ......................................................84

4.1.2.4. Hợp chất NH-GL: β-1,3/1,6 glucan (lentinan) ......................................88

4.1.3. Đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập từ nấm hương ....89

4.2. Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của nấm hầu thủ ..........................92

4.2.1. Tách phân đoạn và đánh giá hoạt tính chống ung thư................................92

4.2.2. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập từ nấm hầu thủ............................94

viii

4.2.2.1. Hợp chất HT1: axit stearic........................................................................94

4.2.2.2. Hợp chất HT2: Ergosterol peroxide .........................................................97

4.2.2.3. Hợp chất HT3 - Cerebroside B.................................................................99

4.2.2.4. Hợp chất HT4 - Hericenone D ...............................................................104

4.2.2.5. Hợp chất HT5 - Ergosterol ....................................................................110

4.2.2.6. Hợp chất HT6 - β-Adenosine .................................................................112

4.2.3. Đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập từ nấm hầu thủ ...118

4.3. Nghiên cứu biến đổi β-1,3-glucan từ nấm hầu thủ thành hoạt chất dễ tan hơn

và đánh giá hoạt tính của chúng ..........................................................................121

4.3.1. Thủy phân bằng enzyme -1,3-glucanase.................................................122

4.3.2. Dùng β-1,3/1,6-glucan từ nấm hầu thủ làm chất mang curcumin.............124

4.4. Thử nghiệm tác dụng dược lý chế phẩm HG1 trên động vật thực nghiệm...128

4.4.1. Kết quả nghiên cứu độc tính cấp của sản phẩm theo đường uống của chế

phẩm HG1............................................................................................................128

4.4.2. Độc tính bán trường diễn của sản phẩm HG1 khi cho uống trên động vật

thực nghiệm .........................................................................................................129

4.4.2.1. Ảnh hưởng của HG1, cho CNT uống trường diễn đối với khối lượng gan,

lách, thận động vật...............................................................................................130

4.4.2.2. Kết quả nghiên cứu trọng lượng cơ thể CNT, khối lượng gan, lách, thận

và tỷ số giữa khối lượng mỗi tạng so với trọng lượng cơ thể .............................131

4.4.2.3. Ảnh hưởng của sản phẩm cho uống bán trường diễn đến các chỉ tiêu huyết

học trên động vật thực nghiệm ............................................................................132

4.4.2.4. Ảnh hưởng của sản phẩm đến các thông số hóa sinh động vật khi cho

uống bán trường diễn...........................................................................................133

4.4.2.5. Ảnh hưởng của sản phẩm dùng uống 6 tuần đến chức năng tim thỏ được

đo điện tim...........................................................................................................134

4.4.2.6. Ảnh hưởng của sản phẩm đến các thông số mô bệnh học khi dùng trường

diễn.......................................................................................................................135

4.4.3. Kết quả nghiên cứu một số tác dụng của sản phẩm HG1 .........................136

ix

4.4.3.1. Tác dụng bảo vệ gan của sản phẩm trên chuột nhắt được gây độc gan

bằng carbon tetraclorid ........................................................................................136

4.4.3.2. Ảnh hưởng của sản phẩm uống bán trường diễn đến quá trình tổng hợp

protein trên động vật thực nghiệm.......................................................................137

4.4.3.3. Tác dụng trên hệ miễn dịch của sản phẩm .............................................138

4.4.3.4. Kết quả đánh giá tỷ lệ sống/chết của CNT sau chiếu xạ dưới tác dụng của

sản phẩm..............................................................................................................139

4.4.3.5. Kết quả nghiên cứu tác dụng tên các dòng tế bào có chức năng miễn dịch

.............................................................................................................................140

4.4.3.6. Kết quả nghiên cứu về phản ứng quá mẫn muộn với kháng nguyên đặc

hiệu dưới tác dụng của sản phẩm ........................................................................141

4.4.4. Thử nghiệm tác dụng của sản phẩm HG1 lên tế bào ung thư ...................144

4.4.4.1. Tác dụng của sản phẩm HG1 lên hồng cầu và tế bào ung thư biểu mô cổ

trướng Ehrlich (EAC) in vitro .............................................................................144

4.4.4.2. Tác dụng của hỗn hợp HG1 lên tế bào ung thư biểu mô cổ trướng Ehrlich

(EAC) in vivo ......................................................................................................144

4.4.4.1. Tác dụng của chế phẩm HG1 lên khối tế bào ung thư Ehrlich in vivo ..144

KẾT LUẬN .........................................................................................................147

KIẾN NGHỊ.........................................................................................................149

CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN...............150

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................152

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC ..............................Error! Bookmark not defined.

x

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Danh sách nấm dược liệu tiêu biểu và đặc tính chữa bệnh.....................5

Bảng 1.2. Các chất phân tử lượng nhỏ có hoạt tính kháng u ..................................9

Bảng 1.3. Nguồn gốc, kiểu và hoạt tính polysaccharide từ một số nấm dược liệu19

Bảng 1.4. Các thụ thể nhận biết khuôn mẫu với một số polysaccharide ..............28

Bảng 1.5. Giá trị y học và một số chất hoạt tính từ nấm hương............................37

Bảng 3.1. Kết quả thủy phân không hoàn toàn β-1,3-glucan từ nấm hầu thủ bằng

enzym -1,3-glucanase..........................................................................................63

Bảng 4.1. Polysaccharide trong các phân đoạn tách chiết nấm hương .................73

Bảng 4.2. Hoạt tính gây độc tế bào các cặn chiết của nấm hương........................74

Bảng 4.3. Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế tạo u trên thạch mềm của các phân

đoạn polysaccharide ..............................................................................................74

Bảng 4.4. Hoạt tính gây độc tế bào các phân đoạn ...............................................75

Bảng 4.5. Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế tạo u trên thạch mềm của các phân

đoạn........................................................................................................................76

Bảng 4.6. Kết quả phổ 13C- NMR của NH2 ..........................................................83

Bảng 4.7. Số liệu phổ NMR của hợp chất NH3 và hợp chất tham khảo...............86

Bảng 4.8. So sánh phổ 13C-NMR của lentinan và β-1,3/1,6 tinh sạch ..................89

Bảng 4.9. Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập từ nấm hương .....90

Bảng 4.10. Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế tạo u tế bào ung thư gan Hep-G2

trên thạch mềm của các hợp chất...........................................................................91

Bảng 4.11. Hàm lượng polysaccharide trong các phân đoạn tách chiết nấm hầu

thủ và nấm hương ..................................................................................................92

Bảng 4.12. Hoạt tính gây độc tế bào các phân đoạn chiết tách từ nấm hầu thủ....93

Bảng 4.13. Hoạt tính kháng u trên thạch của các cặn chiết nấm hầu thủ..............94

Bảng 4.14. Kết quả phổ NMR của HT3 ..............................................................103

Bảng 4.15. Kết quả phổ NMR của HT4 ..............................................................107

Bảng 4.16. Kết quả phổ NMR của HT6 ..............................................................113

Bảng 4.17. giá trị tín hiệu phổ 13C-NMR của -1,3/1,6 glucan hầu thủ ............118

xi

Bảng 4.18. Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập từ nấm Hầu thủ119

Bảng 4.19. Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế tạo u tế bào ung thư gan HepG2

trên thạch mềm của các hợp chất.........................................................................120

Bảng 4.20. Hoạt tính gây độc tế bào của các β-1,3/1,6-glucan với trọng lượng

phân tử khác nhau................................................................................................123

Bảng 4.21. Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế tạo u trên thạch mềm của β￾1,3/1,6-glucan có trọng lượng phân tử khác nhau...............................................124

Bảng 4.22. Kết quả thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào và hoạt tính ức chế tạo u

trên thạch mềm của các sản phẩm trên dòng tế bào HepG2................................128

Bảng 4.23. Độc tính cấp của sản phẩm theo đường uống trên CNT...................129

Bảng 4.24. Chỉ số tăng trọng lượng ở các nhóm trắng, nhóm chứng, sản phẩm

nghiên cứu khi cho uống mức liều 3,0 g/kg bán trường diễn sản phẩm trên chuột

nhắt trắng .............................................................................................................131

Bảng 4.25. Kết quả nghiên cứu về trọng lượng cơ thể và khối lượng các tạng ở

mức liều sản phẩm là 3,0 g/kg/24h trong 42 ngày. .............................................132

Bảng 4.26. Các thông số huyết học khi dùng sản phẩm cho dùng uống bán trường

diễn với mức liều 3,0g/kg/24h.............................................................................133

Bảng 4.27. Các chỉ tiêu hóa sinh về chức năng gan, thận khi dùng sản phẩm bán

trường diễn liều 3,0 g/kg/24 giờ ..........................................................................133

Bảng 4.28. Kết quả nghiên cứu điện tim thỏ dưới tác dụng của sản phẩm liều 3,0

g/kg TLCT tại các thời điểm (n=12) ...................................................................134

Bảng 4.29. Kết quả nghiên cứu về mô bệnh học của gan, lách, thận khi uống sản

phẩm bán trường diễn liều 3,0 g/kg/TLCT..........................................................135

Bảng 4.30. Kết quả định lượng hoạt độ các enzym AST, ALT và γGT ở các nhóm

chuột nhắt nghiên cứu dưới tác dụng của sản phẩm............................................136

Bảng 4.31. Kết quả định lượng khối lượng gan ở các nhóm chuột nhắt nghiên cứu137

Bảng 4.32. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của sản phẩm uống liều 1,0

g/kg/TLCT đến lượng protein toàn phần (tính bằng g/L) ở huyết tương động vật

thực nghiệm (n=12) .............................................................................................138

xii

Bảng 4.33. Tác dụng của sản phẩm về tác dụng trên hệ miễn dịch ở động vật thực

nghiệm dùng uống liều 1,0 g/kg TLCT/24h và 3,0 g/kg TLCT/24h trên các chỉ

tiêu khối lượng các cơ quan miễn dịch................................................................138

Bảng 4.34. Tỷ lệ chuột nhắt sống sót sau chiếu xạ liều 7.0 Gy dưới tác dụng của

sản phẩm liều 1,0 g/kg TLCT-CNT ....................................................................139

Bảng 4.35. Ảnh hưởng của sản phẩm đến kết quả định lượng các tế bào tủy, bạch

cầu và quần thể coloni lách ở CNT .....................................................................140

Bảng 4.36. Ảnh hưởng của sản phẩm đến tỷ số thực bào và chỉ số thực bào .....141

Bảng 4.37. Kết quả đo phản ứng quá mẫn muộn với kháng nguyên đặc hiệu trên

CNT dưới tác dụng của HG1 liều 1,0 g/kg TLCT (chiếu xạ 7.0 Gy, sau đó uống

sản phẩm).............................................................................................................141

Bảng 4.38. Kết quả đo phản ứng quá mẫn muộn trên chuột nhắt dưới tác dụng của

sản phẩm; uống sản phẩm liều 1,0 g/kg TLCT, sau đó được chiếu xạ 7,0 Gy ...142

Bảng 4.39. Kết quả đo phản ứng quá mẫn muộn trên CNT chiếu xạ 7,0 Gy không

dùng sản phẩm. ....................................................................................................143

Bảng 4.40. Ảnh hưởng của HG1 (10 mg/kg) lên sự ức chế phát triển khối tế bào

ung thư Ehrlich ở chuột (số trung bình ± s.e; n = 10; p<0.05)............................145

Bảng 4.41. Ảnh hưởng của HG1 lên chỉ số tăng tuổi thọ của chuột có khối tế bào

ung thư Ehrlich. Ước tính tuổi thọ trung bình được xác định sau 30 ngày kể từ khi

bắt đầu thí nghiệm (số trung bình ± s.e; n = 10; p<0,05)....................................145

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC

xiii

DANH MỤC SƠ ĐỒ VÀ HÌNH

Hình 1.1: Kết nối các polymer trong thành tế bào nấm. .......................................21

Hình 1.2. cấu trúc hóa học điển hình của β1,3/1,6 glucan..................................22

Hình 1.3. Các dạng cấu trúc của βglucan và sự chuyển đổi giữa chúng.............24

Hình 1.4. Cấu trúc của lentinan .............................................................................25

Hình 1.5. Cấu trúc β1,3/1,6 glucan của schizophyllan........................................26

Bảng 1.4. Các thụ thể nhận biết khuôn mẫu với một số polysaccharide ..............28

Hình 1.6. Mô hình glucan hoạt hóa tế bào miễn dịch gây phá hủy tác nhân gây

bệnh (Leung, 2006) [81]........................................................................................29

Hình1.7. Tác dụng y học của nấm hương (Bisten et al. 2010).............................37

Sơ đồ 3.1: Sơ đồ chiết phân đoạn mẫu nấm hương...............................................54

Sơ đồ 3.2: Sơ đồ phân lập các hợp chất NH2 và NH3 ..........................................55

Sơ đồ 3.3. Sơ đồ tinh sạch β-1,3/1,6 glucan từ nấm Hương .................................57

Sơ đồ 3.4: Sơ đồ chiết phân đoạn mẫu nấm Hầu thủ ............................................59

Sơ đồ 3.5: Sơ đồ phân lập các hợp chất HT1 và HT2..........................................60

Sơ đồ 3.6. Sơ đồ tinh sạch β-1,3/1,6 glucan từ nấm hầu thủ.................................62

Sơ đồ 3.7. Sơ đồ Thủy phân β-1,3/1,6 glucan từ nấm hầu thủ bằng emzyme ......64

Sơ đồ 3.8 Sơ đồ tạo hỗn hợp β-1,3/1,6 glucan từ nấm hầu thủ và curcumin ........65

Hình 4.1. Phổ 1H-NMR của NH1..........................................................................77

Hình 4.2. Phổ 13C-NMR và các phổ DEPT của NH1............................................78

Hình 4.3. Phổ COSY của NH1..............................................................................78

Hình 4.4. Phổ HMBC của NH1.............................................................................79

Hình 4.5. Phổ ESI-MS của NH1 ...........................................................................79

Hình 4.6. Cấu trúc hóa học hợp chất NH1 ............................................................80

Hình 4.7. Phổ 13C-NMR của hợp chất NH2 ..........................................................80

Hình 4.8. Phổ 13C-NMR và các phổ DEPT của NH2............................................81

Hình 4.9. Phổ 1H-NMR của NH2..........................................................................82

Hình 4.10. Cấu trúc hóa học của NH2...................................................................84

Hình 4.11. Phổ ESI-MS của NH3 .........................................................................84

xiv

Hình 4.12. Phổ 1H-NMR của NH3........................................................................85

Hình 4.13. Phổ 13C-NMR của NH3.......................................................................86

Hình 4.14. Cấu trúc hóa học của NH3...................................................................87

Hình 4.15. Phổ 13C-NMR của NH-GL ..................................................................88

Hình 4.16. Ức chế phát triển khối u tế bào Hep-G2 bởi các chất phân lập...........91

Hình 4.17. Phổ 1H-NMR của HT1 ........................................................................95

Hình 4.18. Phổ 13C-NMR của HT1 .......................................................................95

Hình 4.19. Phổ ESI-MS của HT1..........................................................................96

Hình 4.20. Cấu trúc hóa học của hợp chất HT1 ....................................................97

Hình 4.21. Phổ ESI-MS của HT2..........................................................................97

Hình 4.22. Phổ 13C-NMR của HT2 .......................................................................98

Hình 4.23. Phổ 1H-NMR của HT2 ........................................................................99

Hình 4.24. Cấu trúc hóa học của HT2...................................................................99

Hình 4.25. Phổ ESI-MS của HT3........................................................................100

Hình 4.26. Phổ 1H-NMR của HT3 ......................................................................100

Hình 4.27. Phổ 13C-NMR và các phổ DEPT của HT3 ........................................101

Hình 4.28. Phổ HMBC của HT3 .........................................................................102

Hình 4.29. Phổ HSQC của HT3 ..........................................................................102

Hình 4.30. Cấu trúc hóa học của HT3.................................................................104

Hình 4.31. Phổ ESI-MS của HT4........................................................................105

Hình 4.32. Phổ 1H-NMR của HT4 ......................................................................105

Hình 4.33. Phổ 13C-NMR và các phổ DEPT của HT4 ........................................106

Hình 4.34. Phổ HSQC của HT4 ..........................................................................107

Hình 4.35. Phổ HMBC của HT4 .........................................................................109

Hình 4.36. Cấu trúc hóa học của HT4.................................................................109

Hình 4.37. Phổ 1H-NMR của HT5 ......................................................................110

Hình 4.38. Phổ 13C-NMR của HT5 .....................................................................111

Hình 4.39. Phổ 13C-NMR và các phổ DEPT của HT5 ........................................111

Hình 4.40. Cấu trúc hóa học của HT5.................................................................112

xv

Hình 4.41. Phổ ESI-MS của HT6........................................................................112

Hình 4.42. Phổ 1H-NMR của HT6 .....................................................................113

Hình 4.43. Phổ 13C-NMR và các phổ DEPT của HT6 ........................................114

Hình 4.44. Phổ HSQC của HT6 ..........................................................................114

Hình 4.45. Phổ HMBC của HT6 .........................................................................115

Hình 4.46. Cấu trúc hóa học của HT6.................................................................115

Hình 4.47. Phổ 13C-NMR của HT-GL.................................................................117

Hình 4.48. Ức chế phát triển khối u tế bào HepG2 bởi các chất phân lập ..........121

Hình 4.49. Dùng cột sephadex G-100 kiểm tra Mw phân đoạn HT-GL1, HT-GL2

và HT-GL3 sau khi ủ với enzyme và tách phân đoạn bằng EtOH 25, 40 và 70%.122

Hình 4.50. Phổ hấp thụ điện tử của Cur và Cur-Glu...........................................126

Hình 4.51. Phổ huỳnh quang của Cur và Cur-Glu. .............................................126

Hình 4.52. Ảnh FESEM của Glu (a), Cur (b) và Cur-Glu (c,d)..........................127

Hình 4.53. Hình ảnh minh họa độ hòa tan của hỗn hợp Glu- Cur so sánh với

Curcumin (độ tan của Glu-Cur (a) và Cur (b))....................................................127

Hình 4.54. Ảnh huỳnh quang của hạt Cur (a) và Cur-Glu (b).............................127