Nghiên cứu chế tạo globulin miễn dịch từ trứng gà (IgY) kháng trực khuẩn mủ xanh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG

HỌC VIỆN QUÂN Y

TIM SUNNARY

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO

GLOBULIN MIỄN DỊCH TỪ TRỨNG GÀ (IgY)

KHÁNG TRỰC KHUẨN MỦ XANH

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

HÀ NỘI - 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG

HỌC VIỆN QUÂN Y

TIM SUNNARY

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO

GLOBULIN MIỄN DỊCH TỪ TRỨNG GÀ (IgY)

KHÁNG TRỰC KHUẨN MỦ XANH

Chuyên ngành: Dị ứng và Miễn dịch

Mã số: 62.72.01.09

LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC

Cán bộ hướng dẫn:

PGS.TS LÊ VĂN ĐÔNG

TS. LÊ THU HỒNG

HÀ NỘI NĂM 2013

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi cùng các thầy

cô ở Bộ môn Miễn dịch, Trung tâm nghiên cứu ứng dụng sinh y dược học,

Bộ môn – Khoa Vi sinh y học, Bộ môn – Khoa Giải phẫu bệnh, Học viện

Quân y. Các số liệu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công

bố trong bất kỳ một luận án, luận văn nào khác.

TÁC GIẢ LUẬN ÁN

Tim Sunnary

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy cô: TS Lê Văn Đông,

TS Lê Thu Hồng, TS Nguyễn Đặng Dũng đã hết lòng động viên, tận tình

giúp đỡ, trực tiếp hướng dẫn tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và

hoàn thành luận án.

Tôi xin chân thành cảm ơn: Ban giám đốc Học Viện Quân Y, Ban

giám đốc Bệnh viện 103, Phòng đào tạo Sau đại học, Phòng quản lý nghiên

cứu khoa học Học viện Quân y; Đại Sự Quán đặc mệnh toàn quyền và Tuỳ

Viên Quân Sự Vương quốc Căm-Pu-Chia tại Việt Nam đã tạo mọi điều

kiện cho tôi thực hiện đề tài nghiên cứu của luận án.

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ nhân viên các đơn vị: Hệ

Quốc Tế, Bộ môn Miễn Dịch, Phòng Protein-Độc chất-Tế bào, Trung tâm

nghiên cứu ứng dụng sinh y dược học, Bộ môn – Khoa Vi sinh y học, Bộ

môn – Khoa Giải phẫu bệnh, Học viện Quân y đã tận tình hướng dẫn và hỗ

trợ kỹ thuật cho tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành đề tài

nghiên cứu của luận án.

Cảm ơn các anh các chị và các bạn đồng nghiệp đã thân ái giúp đỡ

động viên tôi trong suốt quá trình nghiên cứu, học tập; Cảm ơn mọi người

thân và gia đình đã hỗ trợ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành

luận án.

NGHIÊN CỨU SINH

Tim Sunnary

DANH MỤC CÁC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT

SỬ DỤNG TRONG LUẬN ÁN

BCTT Bạch cầu trung tính

ĐVDT Đơn vị diện tích

ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay

(thử nghiệm miễn dịch hấp phụ gắn enzym)

HGKT Hiệu giá kháng thể

HT Huyết thanh

HTKTKMX Huyết thanh kháng trực khuẩn mủ xanh

IgY Yolk Immunoglobin (globulin miễn dịch IgY

hay kháng thể IgY)

KDa Kilo Dalton

NKBV Nhiễm khuẩn bệnh viện

NKH Nhiễm khuẩn huyết

NMSL Nước muối sinh lý

SLVK Số lượng vi khuẩn

TKMX Trực khuẩn mủ xanh

TN Thí nghiệm

WB Western blot

MỤC LỤC

Trang phụ bìa

Lời cam đoan

Lời cảm ơn

Mục lục

Danh mục các từ viết tắt sử dụng trong luận án

Danh mục các bảng

Danh mục các hình

ĐẶT VẤN ĐỀ........................................................................................................................... 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN.................................................................................................. 3

1.1. TRỰC KHUẨN MỦ XANH ..........................................................................3

1.1.1 Đặc điểm hình thể ............................................................................. 3

1.1.2. Đặc điểm nuôi cấy............................................................................ 3

1.1.3. Khả năng gây bệnh........................................................................... 5

1.1.4. Sức đề kháng và khả năng kháng kháng sinh .................................. 6

1.1.5. Phân loại trực khuẩn mủ xanh theo type huyết thanh...................... 6

1.2. NHIỄM KHUẨN VẾT BỎNG DO TRỰC KHUẨN MỦ XANH ..............7

1.2.1. Tình hình nhiễm khuẩn vết bỏng do trực khuẩn mủ xanh............... 7

1.2.2. Điều kiện thuận lợi cho sự phát triển trực khuẩn mủ xanh ở

bệnh nhân bỏng................................................................................ 8

1.2.3. Một số đặc điểm của nhiễm khuẩn tại vết bỏng do ......................... 9

1.3. CÁC BIỆN PHÁP MIỄN DỊCH TRONG PHÒNG VÀ ĐIỀU TRỊ

NHIỄM TRỰC KHUẨN MỦ XANH.........................................................10

1.3.1. Vắc-xin trực khuẩn mủ xanh........................................................... 10

1.3.2. Huyết thanh kháng trực khuẩn mủ xanh......................................... 12

1.3.3. Kết hợp vắc-xin, huyết thanh và kháng sinh trong phòng và

điều trị nhiễm khuẩn trực khuẩn mủ xanh...................................... 15

1.4. CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO KHÁNG THỂ LÒNG ĐỎ TRỨNG (IgY)

BẰNG PHƯƠNG PHÁP GÂY MIỄN DỊCH CHO GÀ MÁI THU

KHÁNG THỂ ĐẶC HIỆU TỪ TRỨNG GÀ ............................................16

1.4.1. Hệ thống miễn dịch của gà.............................................................. 16

1.4.2. Kháng thể IgY................................................................................. 18

1.4.3. Tính ưu việt của công nghệ sản xuất IgY ....................................... 19

1.5. ỨNG DỤNG CỦA IgY ..................................................................................22

1.5.1. Ứng dụng của IgY trong chẩn đoán................................................ 22

1.5.2. Ứng dụng của IgY trong dự phòng và điều trị bệnh....................... 22

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..... 25

2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU.......................................................................25

2.1.2. Động vật để gây bỏng thực nghiệm và lây nhiễm trực khuẩn mủ

xanh ................................................................................................. 26

2.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU...........................................................................26

2.2.1. Trực khuẩn mủ xanh ....................................................................... 26

2.2.2. Hoá chất sinh phẩm......................................................................... 26

2.2.3. Thiết bị máy móc ............................................................................ 27

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................27

2.3.2. Gây miễn dịch ................................................................................. 28

2.3.3. Tách chiết, tinh sạch IgY từ trứng gà ............................................. 29

2.3.4.Điện di SDS-PAGE phân tích thành phần protein kháng nguyên

của trực khuẩn mủ xanh và độ tinh sạch của chế phẩm IgY .......... 31

2.3.5. Xét nghiệm ELISA phát hiện kháng thể IgY đặc hiệu với trực

khuẩn mủ xanh trong máu gà và sản phẩm tách chiết từ trứng gà..... 32

2.3.6. Phân tích kháng thể IgY đặc hiệu với trực khuẩn mủ xanh bằng

kỹ thuật Western blot...................................................................... 33

2.3.7. Thử nghiệm ngưng kết vi khuẩn..................................................... 33

2.3.8. Thử nghiệm tạo vòng kháng khuẩn in vitro trên môi trường

đặc ................................................................................................... 34

2.3.9. Đánh giá độ ổn định của kháng thể IgY trong quá trình bảo

quản................................................................................................. 34

2.3.10. Gây bỏng thỏ thực nghiệm............................................................ 35

2.3.11. Gây nhiễm khuẩn vết bỏng ........................................................... 36

2.3.12. Điều trị vết bỏng nhiễm trực khuẩn mủ xanh ............................... 37

2.3.13. Xác định số lượng vi khuẩn tại vết thương................................... 37

2.3.14. Xét nghiệm mô bệnh học .............................................................. 39

2.3.15. Phương pháp xử lý số liệu ............................................................ 41

2.4. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU...........................................................................41

2.5. ĐẠO ĐỨC NGHIÊN CỨU ...........................................................................41

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ ....................................................................................................... 42

3.1. CHẾ TẠO GLOBULIN MIỄN DỊCH TỪ LÒNG ĐỎ TRỨNG GÀ

KHÁNG TRỰC KHUẨN MỦ XANH .......................................................42

3.1.1. Kết quả gây miễn dịch tạo kháng thể IgY đặc hiệu với trực

khuẩn mủ xanh................................................................................ 42

3.1.2. Tách chiết, tinh sạch IgY từ lòng đỏ trứng gà ................................ 48

3.1.3. Độ ổn định của chế phẩm kháng thể IgY trong các điều kiện

bảo quản khác nhau......................................................................... 56

3.2. HIỆU QUẢ ỨC CHẾ TRỰC KHUẨN MỦ XANH TRÊN IN VITRO

VÀ TRÊN VẾT THƯƠNG NHIỄM TRỰC KHUẨN MỦ XANH

THỰC NGHIỆM CỦA KHÁNG THỂ THU ĐƯỢC................................58

3.2.1. Hiệu quả ức chế trực khuẩn mủ xanh trên in vitro ........................ 58

3.2.2. Kết quả điều trị vết bỏng thực nghiệm trên thỏ nhiễm bằng chế

trực khuẩn mủ xanh phẩm IgY kháng trực khuẩn mủ xanh .......... 61

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN..................................................................................................... 69

4.1. CHẾ TẠO GLOBULIN MIỄN DỊCH TỪ LÒNG ĐỎ TRỨNG GÀ

KHÁNG TRỰC KHUẨN MỦ XANH .......................................................69

4.1.1. Về gây miễn dịch tạo kháng thể IgY đặc hiệu ở gà mái đẻ

trứng................................................................................................ 69

4.1.2. Về tách chiết, tinh sạch kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng gà ........... 74

4.1.3. Về độ ổn định của chế phẩm kháng thể IgY................................... 75

4.2. HIỆU QUẢ ỨC CHẾ TRỰC KHUẨN MỦ XANH TRÊN IN VITRO

VÀ TRÊN VẾT THƯƠNG NHIỄM TRỰC KHUẨN MỦ XANH

THỰC NGHIỆM CỦA KHÁNG THỂ THU ĐƯỢC................................77

4.2.1. Về hoạt tính in vitro của chế phẩm kháng thể IgY kháng trực

khuẩn mủ xanh................................................................................ 77

4.2.2. Về kết quả điều trị vết bỏng nhiễm bằng trực khuẩn mủ xanh

chế phẩm kháng thể IgY kháng trực khuẩn mủ xanh .................... 79

KẾT LUẬN .............................................................................................................................. 83

KIẾN NGHỊ............................................................................................................................. 84

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng Tên bảng Trang

1.1. Một số kết quả lâm sàng của huyết thanh kháng trực khuẩn mủ xanh......... 14

1.2. Tính ưu việt của IgY so với IgG............................................................. 20

3.1. Hiệu suất tách chiết IgY từ lòng đỏ trứng............................................... 55

3.2. Hoạt tính ngưng kết từng chủng của trực khuẩn mủ xanh IgY kháng

trực khuẩn mủ xanh................................................................................. 59

3.3. Tỷ lệ % các loài vi khuẩn phân lập trên vết bỏng thỏ nhiễm trực khuẩn

mủ xanh chủng 6P11............................................................................... 64

3.4. Tổn thương mô học vết thương bỏng thực nghiệm gây nhiễm trực

khuẩn mủ xanh sau 10 ngày được điều trị .............................................. 66

4.1. Khuyến cáo cách gây miễn dịch ............................................................. 71

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình Tên hình Trang

1.1. Trực khuẩn mủ xanh. ................................................................................ 5

1.2. Hệ thống kháng thể của gà mái............................................................... 17

1.3. Cấu trúc phân tử IgY của gà so với IgG của động vật có vú.................. 19

2.1. Gà mái gây miễn dịch chế tạo IgY kháng trực khuẩn mủ xanh.............. 25

2.2. Gây miễn dịch cho gà mái với kháng nguyên trực khuẩn mủ xanh............. 29

2.3. Hệ thống sắc ký trao đổi ion (BioRad, Mỹ)............................................ 31

2.4. Gây bỏng thực nghiệm và vết bỏng mới sau gây bỏng........................... 35

2.5. Gây nhiễm khuẩn vết bỏng với trực khuẩn mủ xanh.............................. 36

2.6. Lấy mẫu xác định số lượng vi khuẩn tại vết thương............................... 38

2.7. Sơ đồ nghiên cứu..................................................................................... 40

3.1. Biến động hiệu giá IgY đặc hiệu trực khuẩn mủ xanh trong máu gà

trước và sau khi gây miễn dịch ở các lô gà thí nghiệm. ......................... 42

3.2. Hoạt tính IgY đặc hiệu trực khuẩn mủ xanh trong lòng đỏ trứng gà

được đẻ ra sau lần gây miễn dịch thứ 5 ở các lô gà thí nghiệm.............. 44

3.3. Hoạt tính IgY trong lòng đỏ trứng gà kháng từng chủng trực khuẩn mủ

xanh riêng rẽ........................................................................................... 45

3.4. Kết quả phân tích hoạt tính kháng thể IgY đặc hiệu với các kháng nguyên

của từng chủng trực khuẩn mủ xanh bằng kỹ thuật Western blot............... 47

3.5. Ảnh hưởng các tỉ lệ pha loãng lòng đỏ trứng/nước đến hiệu quả tách

chiết IgY.................................................................................................. 49

3.6. Ảnh hưởng của pH đến hiệu quả tách chiết IgY..................................... 50

3.7. Ảnh hưởng của nồng độ sulphat amoni bão hòa đến hiệu quả tách

chiết IgY................................................................................................ 51