Nghiên cứu chế tạo bộ xét nghiệm ELISA phát hiện nọc rắn độc và ứng dụng lâm sàng chuẩn đoán rắn độc cắn ở Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG

HỌC VIỆN QUÂN Y

ĐỖ KHẮC ĐẠI

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO BỘ XÉT NGHIỆM ELISA

PHÁT HIỆN NỌC RẮN ĐỘC VÀ ỨNG DỤNG LÂM SÀNG

CHẨN ĐOÁN RẮN ĐỘC CẮN Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành: DỊ ỨNG VÀ MIỄN DỊCH

Mã số: 62.72.01.09

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

HÀ NỘI - 2013

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI HỌC VIỆN QUÂN Y

Người hướng dẫn khoa học:

1. PGS. TS. LÊ VĂN ĐÔNG

2. PGS. TS. NGUYỄN TRƯỜNG SƠN

Phản biện 1: GS. TS. VĂN ĐÌNH HOA

Phản biện 2: PGS. TS. NGUYỄN LIỄU

Phản biện 3: GS. TSKH. NGUYỄN THU VÂN

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp trường

vào hồi: giờ ngày tháng năm

Có thể tìm hiểu luận án tại:

1. Thư viện Quốc Gia

2. Thư viện Học viện Quân y

3. ………………………….

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN

1. Đỗ Khắc Đại, Đỗ Minh Trung, Nguyễn Đặng Dũng và Lê Văn

Đông (2009), “Nghiên cứu chế tạo xét nghiệm ELISA phát hiện

nọc của bốn loài rắn độc thường gặp ở Việt Nam và ứng dụng

chẩn đoán rắn độc cắn trên mô hình thực nghiệm”, Tạp chí Y

dược học quân sự, (4), tr. 16 - 23.

2. Đỗ Khắc Đại, Nguyễn Trường Sơn và Lê Văn Đông (2011),

“Nghiên cứu chế tạo xét nghiệm ELISA kiểu sandwich sử dụng 3

loại kháng thể đặc hiệu phát hiện nọc rắn lục xanh và hổ đất”,

Tạp chí Y dược học quân sự, (9), tr. 30 - 37.

3. Đỗ Khắc Đại, Nguyễn Trường Sơn, Trần Quang Bính, Lê

Khắc Quyến và Lê Văn Đông (2012), “Nghiên cứu đánh giá

hiệu quả của xét nghiệm ELISA phát hiện nọc rắn lục xanh và hổ

đất trên lâm sàng”, Tạp chí Y học Việt Nam, 396(1), tr. 112 - 117.

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Rắn độc cắn là một trong những tai nạn nguy hiểm thường gặp ở các

nước nhiệt đới, với trên 2,5 triệu người bị rắn độc cắn và khoảng 125.000

người tử vong do rắn độc cắn mỗi năm [39], [40], [66], [68], [121]. Ở nước ta,

các chuyên gia ước tính mỗi năm có khoảng 30.000 người bị rắn cắn nhưng

phần lớn không được báo cáo ghi nhận đầy đủ do nạn nhân tử vong trước khi

kịp đến cơ sở y tế hoặc được cấp cứu và điều trị theo các biện pháp dân gian

[wilken]. Thống kê số liệu của gần hai nghìn bệnh nhân rắn độc cắn nhập

viện, các chuyên gia của Bệnh viện Chợ Rẫy nhận định một số loài rắn độc

thường gây tai nạn rắn cắn nhất ở khu vực Miền Nam nước ta là rắn lục xanh

(43,3%), hổ đất (23,8%), chàm quạp (19,4%), hổ mèo (10%) và hổ chúa

(1,2%) [77].

Nhiễm độc nọc rắn nếu không được điều trị kịp thời có thể dẫn đến tử

vong hoặc để lại di chứng nặng nề, ảnh hưởng lớn đến chất lượng cuộc sống

của nạn nhân sau khi sống sót [39]. Theo Tổ chức Y tế Thế giới, phương pháp

điều trị hiệu quả nhất cho bệnh nhân bị nhiễm độc nọc rắn là huyết thanh

kháng nọc rắn (HTKNR) [114]. Ở Việt Nam, đã có 2 loại HTKNR thương

phẩm được sử dụng trên lâm sàng đó là huyết thanh kháng nọc rắn lục xanh

và hổ đất do Viện vắc xin và Sinh phẩm y tế (IVAC) ở Nha Trang sản xuất.

Tuy nhiên, việc sử dụng 2 loại huyết thanh kháng nọc rắn đơn đặc hiệu này

chỉ thực sự hiệu quả khi xác định sớm và chính xác loài rắn độc đã gây ra tai

nạn rắn cắn [2]. Cho đến nay, ở nước ta việc chẩn đoán loài rắn độc đã gây ra

tai nạn rắn cắn để sử dụng HTKNR chủ yếu dựa vào kinh nghiệm lâm sàng,

do đó thường bị hạn chế và chỉ được thực hiện ở các bệnh viện tuyến cuối nơi

có các chuyên gia nhiều kinh nghiệm.

Hiện nay trên thế giới đã có một số loại xét nghiệm được dùng để phát

hiện nọc rắn độc của Úc, Ấn Độ và Đài Loan ngay trên thực địa và lâm sàng

2

tại các nước này. Tuy nhiên, do đặc điểm địa lý khác nhau nên có sự phân bố

các loài rắn khác nhau giữa các vùng địa lý. Từ đó, xét nghiệm phát hiện nọc

của loài rắn độc có ở khu vực này không sử dụng được để phát hiện nọc của

loài rắn có ở khu vực khác [15], [56]. Do vậy, cần phải phát triển các xét

nghiệm phát hiện riêng nọc rắn của các loài rắn độc sinh sống ở Việt Nam mà

cho tới nay nước ta vẫn chưa có [5].

Bộ xét nghiệm phát hiện nọc rắn độc là bộ xét nghiệm cấp cứu; Ngoài

khả năng phát hiện nhanh và chính xác nọc độc, bộ xét nghiệm này còn đòi

hỏi phải đơn giản, dễ sử dụng, bền vững trong các điều kiện bảo quản và sử

dụng ở thực địa, nơi có trang thiết bị tối thiểu. Với các lý do trên, kỹ thuật hấp

phụ miễn dịch gắn enzym (enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA)

thường được áp dụng cho mục đích này. Trong các dạng xét nghiệm ELISA,

thì ELISA sandwich sử dụng hệ khuếch đại avidin-biotin (AB-ELISA) và

ELISA sandwich sử dụng kháng thể thứ ba gắn enzym (AbE-ELISA) là hai

dạng thiết kế được ứng dụng nhiều nhất trong phát triển bộ xét nghiệm phát

hiện nọc rắn độc.

Từ những cơ sở lý luận và thực tiễn nêu trên, đề tài: “Nghiên cứu chế

tạo bộ xét nghiệm ELISA phát hiện nọc rắn độc và ứng dụng lâm sàng

chẩn đoán rắn độc cắn ở Việt Nam” được tiến hành nhằm:

1. Chế tạo bộ xét nghiệm AB-ELISA phát hiện nọc độc của 4 loài rắn lục

xanh, hổ đất, chàm quạp, hổ chúa và phát triển bộ xét nghiệm AbE-ELISA

phát hiện nọc độc của 2 loài rắn lục xanh và hổ đất ở Việt Nam.

2. Đánh giá hiệu quả phát hiện nọc và định loài rắn độc của bộ xét nghiệm

ELISA trong các bệnh phẩm lâm sàng.

3

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN

1.1. TAI NẠN RẮN CẮN VÀ CHẨN ĐOÁN RẮN ĐỘC CẮN

1.1.1. Một số loài rắn độc thường gặp gây ra tai nạn rắn cắn ở Việt Nam

Việt Nam là một nước nằm trong vùng nhiệt đới với địa hình và khí hậu

khác nhau giữa các miền Bắc, Trung, Nam. Từ đặc điểm tự nhiên đó đã tạo

nên sự đa dạng sinh học ở nước ta, trong đó có sự đa dạng về các loài rắn

độc. Theo Trần Kiên và Nguyễn Quốc Thắng (1995), Việt Nam có hơn một

trăm loài rắn, trong đó có hàng chục loài rắn độc phân bố cả trên cạn và dưới

nước [8]. Trong đó, một số loài rắn độc thường gặp gây ra tai nạn rắn độc cắn

ở nước ta đó là:

1.1.1.1. Rắn lục xanh (Trimeresurus albolabris)

Hình 1.1. Rắn lục xanh đuôi đỏ

*Nguồn: theo Trần Thị Kim Ngân (2011) [9].

4

Rắn lục xanh (Trimeresurus stejnegeri K. Schmidt, 1925) là loài rắn có

chiều dài dưới 1 m, sống ở trên cây, phần trước cơ thể nhỏ phân biệt rất rõ với

cổ, có hố má. Mặt lưng màu xanh lá cây, mặt bụng màu xanh lá cây nhạt hơn.

Dọc bên thân có thể có đường màu trắng hay vàng, ở cá thể đực đường này

thường có màu đỏ. Mỗi lứa đẻ có từ 3 đến 10 rắn con; rắn sơ sinh trông giống

rắn trưởng thành. Có nọc độc và nguy hiểm [8].

Theo Lê Khắc Quyến (2003) nghiên cứu trên 1997 nạn nhân bị rắn độc

cắn nhập viện Chợ Rẫy điều trị trong 10 năm, thấy rằng số nạn nhân bị rắn lục

xanh cắn chiếm tỷ lệ 43,3% là loài rắn gây ra tai nạn rắn độc cắn nhiều nhất

trong tổng số nạn nhân bị rắn độc cắn được nghiên cứu [77].

1.1.1.2. Rắn hổ đất (Naja naja kaouthia)

Hình 1.2. Rắn hổ đất

*Nguồn: theo Lê Văn Đông (2010) [4].

5

Rắn hổ đất (Naja naja kouthia Linnaeus 1758) ở miền Nam Việt Nam

là loài rắn cỡ lớn, đầu không phân biệt với cổ, không có vảy má. Rắn có khả

năng bạnh cổ khi bị kích thích, khi đó ở phía trên cổ trông rõ một vòng tròn

màu trắng. Rắn hổ miền Bắc Việt Nam (từ Đà Nẵng trở ra), ở hai bên vòng

tròn có giải màu trắng (gọi là gọng kính). Lưng có màu nâu thẫm, vàng lục

hay đen, hoặc đồng màu hoặc có những dải hoa văn như những vạch ngang

đơn hoặc kép sáng màu hơn. Chiều dài cơ thể tới 200 cm [8].

Theo Lê Khắc Quyến (2003) nghiên cứu trên 1997 nạn nhân bị rắn độc

cắn nhập viện Chợ Rẫy điều trị trong 10 năm, thấy rằng số nạn nhân bị rắn hổ

đất cắn chiếm tỷ lệ 23,8 % trong tổng số nạn nhân bị rắn độc cắn được nghiên

cứu [77].

1.1.1.3. Rắn chàm quạp (Calloselasma rhodostoma)

Hình 1.3. Rắn chàm quạp

*Nguồn theo Lê Văn Đông ( 2010) [4]

Rắn chàm quạp (Calloselasma rhodostoma, Boie, in Boie, 1827) là loài

rắn có chiều dài khoảng 100cm với chín vảy che rắn chắc và cân đối ở phía

6

trên đỉnh đầu. Mõm nhọn và chĩa lên phía trên. Sống mũi kéo dài từ mắt đến

mõm. Thân không dày lắm, các vảy trơn nhẵn. Hoa văn trên thân gồm từ 19

đến 31 dấu hình tam giác màu nâu thẫm viền trắng sắp xếp thành từng đôi

hoặc đối diện nhau hoặc xen kẻ. Các con cái đẻ từ 13 đến 30 trứng và canh

giữ trong suốt khoảng thời gian từ 5 đến 7 tuần lễ ấp trứng. Rắn con dài từ 13

- 20cm trông giống như rắn trưởng thành [8].

Theo Lê Khắc Quyến (2003) nghiên cứu trên 1997 nạn nhân bị rắn độc

cắn nhập viện Chợ Rẫy điều trị trong 10 năm, thấy rằng số nạn nhân bị rắn

chàm quạp cắn chiếm tỷ lệ 19,4 % trong tổng số nạn nhân bị rắn độc cắn được

nghiên cứu [77].

1.1.1.4. Rắn hổ mèo (Naja naja siamensis)

Hình 1.4. Rắn hổ mèo

*Nguồn: theo Lê Khắc Quyến (2003) [77].

Rắn hổ mèo (Naja naja siamensis) là loài rắn có đầu không phân biệt

với cổ, không có vảy má. Rắn có khả năng bạnh cổ khi bị kích thích, khi đó ở

7

phía trên cổ nhìn rõ hai vòng tròn cân đối ở hai bên (giống hai mắt kính nên

còn gọi là rắn mắt kính) được nối với nhau bởi một vệt hoa văn hình chữ V

(giống gọng kính hình chữ V). Lưng có màu nâu thẫm, vàng lục hay đen,

hoặc đồng màu. Chiều dài cơ thể tới 160 cm, chiều dài trung bình khoảng 90

– 120 cm. Rắn con non mới nở có hình dạng giống rắn trưởng thành và có khả

năng bạnh cổ [8].

Theo Lê Khắc Quyến (2003) nghiên cứu trên 1997 nạn nhân bị rắn độc

cắn nhập viện Chợ Rẫy điều trị trong 10 năm, thấy rằng số nạn nhân bị rắn hổ

mèo cắn chiếm tỷ lệ 10 % trong tổng số nạn nhân bị rắn độc cắn được nghiên

cứu [77].

1.1.1.5. Rắn hổ mang chúa (Ophiophagus hannah)

Hình 1.5. Rắn hổ chúa

*Nguồn: theo Lê Khắc Quyến (2003) [77].

8

Rắn hổ mang chúa (Ophiophagus hannah Cantor, 1836) là loài rắn độc

có kích thước lớn nhất, chúng có khả năng bạnh cổ song không bạnh to được

bằng rắn hổ mang thường. Mặt trên đầu rắn hổ chúa có 2 tấm vảy chấm lớn.

Lưng rắn trưởng thành có màu vàng lục hay nâu nhiều khi chỉ có màu đen chì.

Cá thể non lưng có màu đen với nhiều vệt ngang sáng, ở cổ có hình chữ V

ngược màu vàng nhạt. Chiều dài cơ thể khoảng 300 – 400 cm, có khi đạt tới

500 cm [8].

Theo nghiên cứu của Lê Khắc Quyến (2003) nhận thấy, tuy tỷ lệ gây tai

nạn của rắn hổ chúa chỉ chiếm 1,2 % nhưng tỷ lệ tử vong của những nạn nhân

bị rắn hổ chúa cắn phải nhập viện lại rất cao, nếu không có huyết thanh điều

trị đặc hiệu [77].

Ngoài những loài rắn được mô tả ở trên còn có một vài loài rắn khác

cũng là thủ phạm gây ra tai nạn rắn độc cắn ở Việt Nam như: Rắn cạp nia

(Bungarus candidus) chiếm tỷ lệ là 2,1 % và rắn biển (sea snakes) chiếm tỷ lệ

là 0,2 % trong tổng số nạn nhân bị rắn độc cắn [77].

1.1.2. Một số đặc điểm lâm sàng rắn độc cắn

Rắn độc cắn là vấn đề y tế và xã hội lớn ở nhiều nước trong các vùng

nhiệt đới và cận nhiệt đới, đặc biệt là ở các nước nghèo và đang phát triển,

trong đó có Việt Nam. Rắn cắn được coi là một tai nạn nghề nghiệp của

những người hoạt động bắt rắn, chăn nuôi rắn, những người làm rừng, nông

dân, ngư dân. Hai khu vực có nhiều nạn nhân bị rắn cắn là Đông Nam Á và

Châu Phi [77].

Tại nước ta, về mặt dịch tễ học, chưa có khảo sát ở cấp độ quốc gia nào

được thực hiện để ước tính tỉ lệ bệnh nhân bị rắn cắn thực tế. Theo nghiên cứu

của Lê Khắc Quyến năm 2003 cho thấy tai nạn rắn cắn xảy ra ở hầu hết các

vùng trong cả nước [77]. Số liệu từ 3 bệnh viện đa khoa khu vực cho thấy số

trường hợp rắn cắn điều trị tại các bệnh viện này là các con số đáng kể. Tại