Nghiên cứu chế tạo bộ sinh phẩm phát hiện HIV bằng Dot Blot với các Protein GP120, GP41, P24 tái tổ hợp

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

…………..o0o…………..

NGUYỄN QUANG ANH

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO BỘ SINH PHẨM PHÁT

HIỆN HIV BẰNG DOT BLOT VỚI CÁC PROTEIN

GP120, GP41, P24 TÁI TỔ HỢP

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

Hà Nội – 2010

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

…………..o0o…………..

NGUYỄN QUANG ANH

NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO BỘ SINH PHẨM PHÁT

HIỆN HIV BẰNG DOT BLOT VỚI CÁC PROTEIN

GP120, GP41, P24 TÁI TỔ HỢP

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

Hà Nội – 2010

Luận văn cao họcK12

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Nguyễn Quang Anh 1

MỤC LỤC

CHƢƠNG I TỔ NG QUAN

Mở đầu------------------------------------------------------------------------------------

1.1 Tình hình nhiễm HIV/AIDS trên thế giới --------------------------------------

1.1.1 Lịch sử quá trình phát hiện HIV/AIDS. ----------------------------------------

1.1.2 Tình hình nhiễm HIV/AIDS trên thế giới. -------------------------------------

1.2 Tình hình nhiễm HIV/AIDS và nghiên cƣ́u HIV ở Việt Nam. -------------

1.3 Đặc điểm của HIV-----------------------------------------------------------------

1.3.1 Giới thiệu chung. ------------------------------------------------------------------

1.3.2 Đặc điểm hình thái cấu trúc HIV.-----------------------------------------------

1.4 Phân loại HIV. ---------------------------------------------------------------------

1.4.1 HIV-1--------------------------------------------------------------------------------

1.4.2 HIV-2--------------------------------------------------------------------------------

1.5 Đặc điểm sinh vật học của HIV. ------------------------------------------------

1.6 Nguồn truyền nhiễm và đối tƣợ ng cảm thụ HIV. -----------------------------

1.7 Các phƣơng thức lây truyền của HIV-------------------------------------------

1.8 Sƣ̣ xâm nhập tế bào và nhân lên củ a HIV. ------------------------------------

1.9 Đáp ƣ́ng miễn dịch củ a cơ thể khi nhiễm HIV/AIDS. -----------------------

1.9.1 Nhƣ̃ng thay đổi miễn dịch khi nhiễm HIV. -----------------------------------

1.9.2 Suy giảm miễn dịch do nhiễm HIV. --------------------------------------------

1.9.3 Diễn biến huyết thanh ngƣời nhiễm HIV/AIDS. ------------------------------

1.10 Các kĩ thuật phát hiện HIV trong cơ thể. --------------------------------------

1.10.1 Phát hiện trực tiếp sự có mặt của HIV. ----------------------------------------

1.10.2Phát hiện kháng nguyên của HIV. ---------------------------------------------

1.10.3Các kỹ thuật sinh học phân tử trong xét nghiệm HIV. ---------------------

1.10.4Phát hiện gián tiếp sự có mặt của HIV. --------------------------------------

1.10.5Các bộ sinh phẩm chẩn đoán HIV. --------------------------------------------

1.10.6Nghiên cƣ́u các protein tái tổ hợ p để tạo kit chẩn đoán. -------------------

1.11 Điều trị HIV/AIDS-----------------------------------------------------------------

CHƢƠNG II ĐỐ I TƢỢ NG, VẬ T LIỆ U VÀ PHƢƠNG PHÁ P NGHIÊN CƢ́ U------

2.1 Đối tƣợng, vật liệu. ---------------------------------------------------------------

2.1.1 Đối tƣợng. --------------------------------------------------------------------------

2.1.2 Các sinh phẩm----------------------------------------------------------------------

2.1.3 Hóa chất vật liệu--------------------------------------------------------------------

2.1.4 Dung dịch và môi trƣờng----------------------------------------------------------

3

5

5

7

8

10

10

10

15

15

18

18

19

19

20

23

23

24

26

28

28

29

30

31

34

35

37

40

40

40

40

40

40

Luận văn cao họcK12

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Nguyễn Quang Anh 2

2.1.5 Thiết bị và máy móc---------------------------------------------------------------

2.2 Phƣơng pháp nghiên cƣ́u---------------------------------------------------------

2.2.1 Phƣơng pháp điện di trên gel và polyacrylamide. -----------------------------

2.2.2 Phƣơng pháp biểu hiện protein tái tổ hợ p trong E. coli chủng BL21. ------

2.2.3 Tinh chế protein dung hợ p bằng cộ t Probond Nikel Resin. ------------------

2.2.4 Phƣơng pháp Western blot--------------------------------------------------------

2.2.5 Định lƣợ ng protein bằng phƣơng pháp Bradford------------------------------

2.2.6 Nuôi cấy biểu hiện và thu nhận protein tái tổ hợ p gp120--------------------

2.2.7 Nuôi cấy biểu hiện và thu nhận protein tái tổ hợ p gp41----------------------

2.2.8 Nuôi cấy biểu hiện và thu nhận protein tái tổ hợ p p24. ----------------------

2.2.9 Phƣơng pháp chế tạo bộ kit dot blot chẩn đoán HIV-------------------------

CHƢƠNG III KẾT QUẢ ĐẠ T ĐƢỢ C-------------------------------------------------

3.1 Biểu hiện protein tái tổ hợ p gp120. --------------------------------------------

3.2 Tinh chế protein tái tổ hợ p. ------------------------------------------------------

3.3 Nghiên cƣ́u khả năng phản ƣ́ng gp120 tái tổ hợp với kháng thể kháng

HIV trong huyết thanh bệnh nhân HIV bằng western blot. -------------------------

3.4 Kết quả biểu hiện, tinh sạ ch gp41 của HIV-1 phân type CRF01_AE. -----

3.4.1 Tối ƣu hóa điều kiện biểu hiện và xác định trạng thái gp41 tái tổ hợp. ----

3.4.2 Tinh sạch gp41 tái tổ hợp---------------------------------------------------------

3.5 Kiểm tra khả năng phát hiện kháng thể kháng HIV trong huyết thanh

bệnh nhân bằng western blot. -----------------------------------------------------------

3.6Biểu hiện và tinh sạch protein p24-----------------------------------------------

3.7Phát hiện kháng thể trong huyết thanh bệnh nhân. ----------------------------

3.8Kết quả nghiên cƣ́u chế tạo bộ kit dot blot chẩn đoán HIV. -----------------

KẾT LUẬ N --------------------------------------.-----------------------------------------

KIẾN NGHỊ-------------------------------------------------------------------------------

PHỤ LỤC ------------------------------------------------------------------------------

44

45

45

46

47

50

50

53

53

54

55

57

57

58

59

61

61

62

65

66

66

66

68

75

77

TÀI LIỆU THAM KHẢO---------------------------------------------------------------- 87

Luận văn cao họcK12

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Nguyễn Quang Anh 3

MỞ ĐẦU

Hơn hai thập kỷ qua, nhân loại phải đƣơng đầu với đại dịch HIV/AIDS nguy

hiểm, có tốc độ lây truyền cao, chƣa có vacxin phòng bệnh và chƣa có thuốc điều trị

đặc hiệu. HIV/AIDS không chỉ là nguyên nhân cƣớp đi hàng triệu sinh mạng trên thế

giới mà còn là hiểm họa tác động nghiêm trọng đến mọi khía cạnh của đời sống xã

hội làm ảnh hƣởng tới kinh tế, văn hoá, xã hội, nòi giống của mỗi quốc gia. Theo báo

cáo của Tổ chức phòng chống AIDS của Liên Hợp Quốc (UNAIDS) và Tổ chức Y tế

thế giới (WHO), đến năm 2008 trên thế giới có 33,4 triệu ngƣời đang sống chung với

HIV, mỗi năm có 2,7 triệu ngƣời nhiễm mới và 2 triệu ngƣời tử vong do AIDS. Tại

Việt Nam, từ khi ca nhiễm đầu tiên đƣợc thông báo vào năm 1990 ở thành phố Hồ

Chí Minh, số lƣợng ngƣời nhiễm HIV đang ngày càng tăng lên. Tính đên 31/3/2009,

toàn quốc có 144.483 ngƣời nhiễm HIV, 30.996 ngƣời đã chuyển sang giai đoạn

AIDS còn sống, 42.447 ngƣời đã tử vong vì AIDS .

Có hai type HIV gây bệnh ở ngƣời là HIV-1 và HIV-2. Tuy nhiên, HIV-2 chỉ

lƣu hành ở châu Phi, còn HIV-1 thì lƣu hành rộng rãi và gây bệnh chủ yếu ở tất cả các

châu lục. Dựa vào sự biến đổi về gen của HIV-1, ngƣời ta chia HIV-1 ra thành 3

nhóm M, N và O. Các nhóm này có thể đƣợc chia ra thành các phân type, mỗi

phân type lại có phân vùng địa lý khác nhau. Ngoài các phân type, các thể tái tổ hợp

giữa các phân type (CRF) cũng đang xuất hiện ngày càng nhiều và làm cho việc

nghiên cứu về HIV-1 ngày càng trở nên phức tạp và khó khăn [41].

Hiểu đƣợc sự lƣu hành của các phân type HIV cũng nhƣ các thể tái tổ hợp của

chúng ở mỗi vùng địa lý khác nhau không chỉ có ý nghĩa quyết định cho việc nghiên

Luận văn cao họcK12

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Nguyễn Quang Anh 4

cứu và triển khai vắc xin phòng chống HIV mà còn có giá trị trong sản xuất kit chẩn

đoán thích hợp cho từng vùng.

Các công trình nghiên cứu về HIV có sự phân biệt ƣu tiên theo địa lý các

nƣớc giàu nghèo. Phân type C xuất hiện chủ yếu tại châu Phi, châu Á và phân type

CRF01_AE lƣu hành chủ yếu tại các nƣớc khu vực Đông Nam Á, tuy nhiên hầu hết

các nghiên cứu về HIV hiện nay đều tập trung vào phân type B, vì phân type này lƣu

hành chủ yếu ở các nƣớc phát triển.

Nghiên cứu để biết rõ hơn về đặc tính di truyền và kháng nguyên của các phân

typ HIV lƣu hành chủ yếu ở Việt Nam từ đó chế tạo các bộ kit chẩn đoán huyết thanh

học có độ nhạy và độ đặc hiệu cao trên cơ sở các kháng nguyên tái tổ hợp GP120,

GP41 và P24 biểu hiện từ các phân typ HIV lƣu hành ở Việt nam là mục tiêu của đề

tài “Nghiên cứu chế tạo bộ sinh phẩm phát hiện HIV bằng dot blot với các protein

GP120, Gp41 và P24 tái tổ hợp”

Đề tài đƣợc đặt ra với các mục tiêu cụ thể sau:

- Tạo ra đƣợc các kháng nguyên GP120, GP41, P24 có độ tinh sạch, độ đặc hiệu

đảm bảo cho chế tạo kit chẩn đoán.

- Xây dựng đƣợc quy trình công nghệ sản xuất bộ kit chẩn đoán HIV bằng dot

blot,độ đặc hiệu cao có thể sử dụng cho chẩn đoán HIV.

Luận văn cao họcK12

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Nguyễn Quang Anh 5

CHƢƠNG I

TỔNG QUAN

1.1. TÌNH HÌNH NHIỄM HIV/AIDS TRÊN THẾ GIỚI

1.1.1. Lịch sử quá trình phát hiện HIV/AIDS

Quá trình diễn biến HIV/AIDS trên thế giới chia 3 giai đoạn [21].

- Thời kỳ “yên lặng” 1970-1981.

HIV đã bắt đầu xuất hiện âm thầm từ những năm 70 của thế kỷ XX. Ngƣời ta đã tìm

thấy kháng thể (KT) kháng HIV trong các mẫu máu đƣợc bảo quản ở Zaire (1959) và

ở Mỹ (1970).

- Thời kỳ phát hiện virus 1981-1985.

Ở thời kỳ này, các nhà khoa học đã phân lập đƣợc virus, xác định đƣợc phƣơng thức

truyền bệnh và phát triển các kỹ thuật phát hiện virus.

+ Năm 1981, Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa bệnh tật Hoa Kỳ (CDC) đã xác

định đƣợc những bệnh nhân mắc hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (AIDS) đầu

tiên trên thế giới dựa trên sự phát hiện và mô tả bệnh của bác sỹ Michạel Gottlieb về

5 thanh niên đồng tính luyến ái bị viêm phổi nặng do Pneumocystis carinii ở Los

Angeles và 226 nam thanh niên đồng tính luyến ái mắc ung thƣ da Sarcoma Kaposi.

Luận văn cao họcK12

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Nguyễn Quang Anh 6

Điều đặc biệt là ở những bệnh nhân này đều có sự suy giảm nặng nề hệ thống miễn

dịch, về cả số lƣợng và chức năng của tế bào miễn dịch, quan trọng nhất là sự giảm tế

bào TCD4.

+ Năm 1982, nhiều nơi đã công bố căn bệnh tƣơng tự nhƣ trên ở các bệnh nhân phải

truyền máu nhiều lần, ở các đối tƣợng nghiện chích ma tuý, ở những ngƣời mẹ và đứa

con do họ đẻ ra.

Cuối 1982, dựa trên những trƣờng hợp AIDS đầu tiên đƣợc thông báo, CDC đã đƣa ra

tiêu chuẩn đầu tiên về các triệu chứng lâm sàng chẩn đoán bệnh AIDS khi chƣa có

phƣơng pháp xét nghiệm căn nguyên.

+ Năm 1985, Hội nghị danh pháp quốc tế đã thống nhất gọi tên các virus LAV

(Lymphodenopathy Associated Virus), HTLV III (Human T Lymphotropic Virus III),

ARV (AIDS Related Virus) là virus gây suy giảm miễn dịch ở ngƣời (Human

Immunodefiency Virus- HIV).

+ Năm1984-1985, đã xác định kỹ thuật phát hiện KT kháng HTLV III và chuẩn hoá

bộ sinh phẩm phát hiện KT kháng HIV bằng kỹ thuật miễn dịch hấp phụ enzym

ELISA để sàng lọc máu và phát hiện lâm sàng

- Thời kỳ 1985- nay: Đây là thời kỳ toàn thế giới chống AIDS.

+ Năm 1987, thử nghiệm lâm sàng đầu tiên với AZT (Azidothymidine) nhƣ một

thuốc chống Retrovirus.

+ Năm 1989, đƣa ra các hƣớng dẫn điều trị bằng AZT cho những ngƣời nhiễm HIV

và bệnh nhân AIDS trên cơ sở số lƣợng tế bào TCD4 của ngƣời bệnh.

Luận văn cao họcK12

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Nguyễn Quang Anh 7

+ Năm 1993, CDC đƣa ra tiêu chuẩn để xác định bệnh AIDS.