Nghiên Cứu Biểu Hiện Protein Tái Tổ Hợp Gp 5 M Của Virus Prrs Gây Hội Chứng Rối Loạn Sinh Sản Và Hô Hấp Ở Lợn

v

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực tập, hoàn thiện khóa luận tốt nghiệp, tại Phòng Công

nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và

Công nghệ Việt Nam em đã nhận đƣợc rất nhiều sự quan tâm và giúp đỡ tận tình

của các giáo viên hƣớng dẫn,cùng các thầy cô và cán bộ nghiên cứu tại phòng

thí nghiệm của Viện, với sự nỗ lực cố gắng của bản thân, em đã hoàn thành khóa

luận tốt nghiệp của mình.

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Chu Hoàng Hà, Viện

trƣởng Viện Công nghệ sinh đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình

thực hiện khóa luận.

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới NCS.ThS. Nguyễn Thị Minh Hằng,

PGS.TS Phạm Bích Ngọc đã giúp đỡ, giảng dạy, đem đến cho em những kiến

thức quý báu về Công nghệ sinh học, ngƣời đã tạo cho em những cơ hội quý báu

để thực hiện niềm say mê nghiên cứu khoa học và cũng là giáo viên hƣớng dẫn

em trong quá trình thực tập tốt nghiệp. Nội dung của đề tài khóa luận này cũng

nằm trong đề tài nghiên cứu sinh của NCS.ThS Nguyễn Thị Minh Hằng.

Em xin chân thành cảm ơn ThS. Hồ Thị Thƣơng, ThS. Nguyễn Thu Giang

cùng toàn thể cán bộ, học viên, sinh viên Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện

Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện làm việc, giúp đỡ và truyền đạt để lại cho

em những kiến thức, kinh nghiệm làm việc quý báu và cần thiết cho bản thân

sau này.

Trong quá trình học,thực tập, hoàn thiện, hoàn thành chƣơng trình học và

khóa luận tốt nghiệp chuyên ngành Công nghệ sinh học tại Trƣờng Đại học Lâm

nghiệp. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh học

Lâm Nghiệp, Ban Giám hiệu Trƣờng Đại học Lâm nghiệp đã tạo điều kiện thuận

lợi cho em học tập, nghiên cứu và giảng dạy em những kiến thức nền tảng làm

phong phú thêm nguồn kiến thức của bản thân em cũng nhƣ là tiền đề trong

công việc ở tƣơng lai sau khi em bƣớc ra khỏi cánh cổng đại học.

vi

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình và bạn bè, những

ngƣời đã luôn bên cạnh động viên, góp ý cho em trong suốt quá trình học tập và

hoàn thành khóa luận.

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 05 tháng 4 năm 2018

Sinh viên

Trần Thị Ngọc

vii

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................... v

MỤC LỤC...........................................................................................................vii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .....................................................................ix

DANH MỤC BẢNG............................................................................................. x

DANH MỤC HÌNH ............................................................................................. xi

MỞ ĐẦU............................................................................................................. 12

Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 3

1.1.Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn .................................................. 3

1.1.1. Giới thiệu chung.......................................................................................... 3

1.1.2. Nguyên nhân gây bệnh lợn tai xanh............................................................ 4

1.1.3. Tình hình dịch bệnh lợn tai xanh ................................................................ 7

1.1.4. Sản xuất vacxin phòng dịch bệnh lợn tai xanh ......................................... 11

1.2. Hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp ở thực vật ......................................... 13

1.3. Sản xuất protein tái tổ hợp tạm thời bằng phƣơng pháp agroinfiltration..... 15

Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 17

2.1. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu................................................................. 17

2.1.1. Mục tiêu nghiên cứu.................................................................................. 17

2.1.2. Nội dung nghiên cứu................................................................................. 17

2.2. Vật liệu nghiên cứu ...................................................................................... 17

2.2.1. Chủng vi khuẩn ......................................................................................... 17

2.2.2. Các vector và vật liệu thực vật.................................................................. 17

2.2.3. Các cặp mồi sử dụng ................................................................................. 18

2.3. Hóa chất, thiết bị .......................................................................................... 18

2.3.1. Hoá chất..................................................................................................... 18

2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu.............................................................................. 19

2.4.1. Phƣơng pháp khuếch đại gen bằng phản ứng PCR................................... 19

2.4.2. Phản ứng nối ghép gen (ligation).............................................................. 20

2.4.3. Biến nạp plasmid vào tế bào E. coli và A. tumefaciens........................... 21

viii

2.4.4. Phƣơng pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR).......................... 22

2.4.5. Tách chiết và tinh sạch plasmid ................................................................ 22

2.4.6. Cắt plasmid kiểm tra bằng enzyme cắt giới hạn ....................................... 24

2.4.7. Phƣơng pháp trong biểu hiện tạm thời...................................................... 24

2.4.8. Tách chiết protein tổng số......................................................................... 25

2.4.9. Phƣơng pháp điện di SDS-Page và lai miễn dịch Western blot ............... 25

Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................... 27

3.1. Thiết kế vector tách dòng pRTRA tái tổ hợp gen mã hóa kháng nguyên

GP5-M gắn kết Elastin like-polypeptide............................................................. 27

3.1.1. Kết quả khuếch đại đoạn gen gp5-m bằng kỹ thuật PCR......................... 27

3.1.2. Tạo vector tách dòng pRTRA tái tổ hợp gen mã hóa kháng nguyên GP5-

M gắn kết Elastin like-polypeptide ..................................................................... 27

3.1.3. Thiết kế vector chuyển gen pCB301 tái tổ hợp gen mã hóa kháng nguyên

GP5-M gắn kết Elastin like-polypeptide............................................................. 30

3.1.4. Tạo chủng vi khuẩn A. tumefaciens mang vector pCB301-gp5-m￾100xELP tái tổ hợp.............................................................................................. 32

3.2. Kết quả biểu hiện gen gp5-m ở cây thuốc lá N. benthamiana ..................... 33

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................................. 36

Kết luận ................................................................................................................ 36

Kiến nghị ............................................................................................................. 36

TÀI LIỆU THAM KHẢO

ix

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

bp Base pair

CMV Cauliflower mosaic virus

cDNA Complementary DNA

DNA Deoxyribonucleic acid

dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate

E. coli Escherichia coli

EDTA Ethylene Diamine Tetra-Acetate

acid

EtBr Ethidium Bromide

HA Hemagglutinin

Kb Kilobase

KDa Kilodalton

LB Luria and Bertani

PBS Phosphate-buffered saline

PCR Polymerase Chain Reaction

PCS Polycloning site

RNA Ribonucleic acid

RNase Ribonuclease

SAP Shrimp alkaline phosphatase

SDS Sodium dodecyl sulfate

TAE Tris Acetate EDTA

Taq DNA polymerase Thermus aquaticus DNA

polymerase

v/p vòng/phút