Nghiên cứu biểu hiện protein interleukin 7 tái tổ hợp trong hệ thống nuôi cấy thực vật

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN HUY HOÀNG

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PROTEIN INTERLEUKIN 7

TÁI TỔ HỢP TRONG HỆ THỐNG NUÔI CẤY THỰC VẬT

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2018

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN HUY HOÀNG

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PROTEIN INTERLEUKIN 7

TÁI TỔ HỢP TRONG HỆ THỐNG NUÔI CẤY THỰC VẬT

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số : 9 42 01 21

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1. PGS. TS. Chu Hoàng Hà

2. PGS. TS. Lê Văn Sơn

THÁI NGUYÊN - 2018

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự

hướng dẫn của PGS. TS. Chu Hoàng Hà và PGS. TS. Lê Văn Sơn. Các số liệu,

kết quả trình bày trong luận văn là trung thực, một phần đã được công bố trong

các Tạp chí Khoa học; phần còn lại chưa từng được ai công bố trong bất kỳ

công trình nào khác. Mọi trích dẫn, tham khảo đều ghi rõ nguồn gốc.

Thái Nguyên, ngày 10 tháng 2 năm 2018

TÁC GIẢ

Nguyễn Huy Hoàng

ii

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận án này, lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu

sắc tới PGS. TS. Chu Hoàng Hà, PGS. TS. Lê Văn Sơn, là những người thầy

đã tận tình hướng dẫn, động viên khích lệ, tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong

suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận án này.

Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới TS. Phạm Bích Ngọc, TS. La

Việt Hồng, ThS. Lê Thu Ngọc, ThS. Nguyễn Thu Giang cùng toàn thể các cô chú,

anh chị và các bạn Phòng Công nghệ tế bào thực vật và Phòng công nghệ ADN

ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học, là những người đã tận tình truyền đạt nhiều

kinh nghiệm quý báu và giúp đỡ tôi trong quá trình làm thực nghiệm tại phòng.

Tôi xin chân thành cảm ơn GS. TS. Chu Hoàng Mậu, PGS. TS. Nguyễn

Thị Tâm và các thầy cô giáo khoa Sinh học Trường Đại học Sư phạm - Đại học

Thái Nguyên đã giảng dạy, truyền đạt cho tôi những kiến thức mới và tạo điều

kiện để tôi có thể hoàn thành được khóa học này.

Tôi xin cảm ơn phòng Đào tạo, cán bộ Bộ phận đào tạo Sau đại học,

Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên đã tạo điều kiện thuận lợi về mặt quản

lý trong suốt quá trình tôi học tập tại trường.

Tôi xin cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Y Dược, đồng nghiệp

của tôi tại Bộ môn Sinh học, Khoa Khoa học cơ bản và các phòng chức năng

đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong công tác để tôi yên tâm học tập.

Cuối cùng tôi xin gửi tới gia đình, bạn bè, người thân lòng biết ơn sâu

sắc. Những người luôn luôn ở bên, ủng hộ, động viên, giúp đỡ tôi trong quá

trình học tập và nghiên cứu của mình

Thái Nguyên, ngày 10 tháng 2 năm 2018

TÁC GIẢ

Nguyễn Huy Hoàng

iii

MỤC LỤC

Lời cam đoan......................................................................................................i

Lời cảm ơn ........................................................................................................ii

Mục lục.............................................................................................................iii

Danh mục chữ viết tắt ......................................................................................iv

Danh mục các bảng ........................................................................................... v

Danh mục các hình...........................................................................................vi

MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1

1. Tính cấp thiết của luận án ............................................................................. 1

2. Mục tiêu nghiên cứu...................................................................................... 2

3. Nội dung nghiên cứu..................................................................................... 2

4. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn của luận án....................................................... 3

4.1. Ý nghĩa lý luận........................................................................................... 3

4.2. Ý nghĩa thực tiễn........................................................................................ 3

5. Đóng góp mới của luận án ............................................................................ 3

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 4

1.1. Vai trò của cytokine và interleukin 7 trong hệ miễn dịch ở người ............ 4

1.1.1. Cytokine .................................................................................................. 4

1.1.2. Interleukin 7 .......................................................................................... 10

1.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng các loại cytokine tái tổ hợp trong y học16

1.2.1. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trên thế giới................................... 16

1.2.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trong nước..................................... 18

1.3. Một số hệ thống biểu hiện protein người tái tổ hợp................................. 19

1.3.1. Hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp ở vi khuẩn ................................. 19

1.3.2. Dòng tế bào thuốc lá BY2 (Nicotiana tabacum Bright Yellow 2)........ 20

1.3.3. Hệ thống nuôi cấy rễ tơ thực vật........................................................... 22

1.3.4. Cây chuyển gen biểu hiện cytokine tái tổ hợp...................................... 24

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................. 29

2.1. Vật liệu ..................................................................................................... 29

2.1.1. Vật liệu thực vật.................................................................................... 29

2.1.2. Các chủng vi khuẩn, tế bào ................................................................... 29

2.1.3. Các gen và vector.................................................................................. 30

2.1.4. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu................................................. 30

2.1.5. Hóa chất và thiết bị máy móc................................................................31

2.1.6 . Địa điểm và thời gian nghiên cứu........................................................ 32

2.2. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 32

2.2.1. Phương pháp thay đổi mã di truyền gen hIL-7 tối ưu biểu hiện protein ở

thực vật............................................................................................................ 34

2.2.2. Thiết kế mồi .......................................................................................... 35

2.2.3. Thiết kế vector chuyển gen mang gen hIL-7 tái tổ hợp ........................ 35

2.2.4. Phương pháp biểu hiện gen ở vi khuẩn, tạo dòng tế bào thuốc lá BY2,

rễ tơ thuốc lá.................................................................................................... 44

2.2.5. Phân tích các chỉ tiêu sinh lý của dòng chuyển gen.............................. 47

2.2.6. Phân tích các dòng chuyển gen bằng kỹ thuật sinh học phân tử .......... 48

2.2.7. Tinh sạch protein hIL-7 tái tổ hợp ........................................................ 50

2.2.8. Đánh giá hoạt tính protein hIL-7 tái tổ hợp .......................................... 50

2.2.9. Phân tích thống kê kết quả thực nghiệm............................................... 52

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................ 53

3.1. Thay đổi mã di truyền gen hIL-7 tối ưu biểu hiện ở thực vật.................. 53

3.2. Thiết kế vector chuyển gen hIL-7 tái tổ hợp vào vi khuẩn, dòng tế bào

BY2, rễ tơ thuốc lá và cây thuốc lá................................................................. 57

3.2.1. Thiết kế vector chuyển gen pET32c(+)/IL7.......................................... 57

3.2.2. Thiết kế vector chuyển gen pENTR221/cal/IL7................................... 59

3.2.3. Thiết kế vector chuyển gen pK7WG2D.1/cal/IL7................................ 61

3.2.4. Thiết kế vector chuyển gen pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP.. 63

3.3. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp............................................................ 68

3.3.1. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong vi khuẩn................................ 68

3.3.2. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong dòng tế bào BY2................... 72

3.3.3. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong dòng rễ tơ chuyển gen .......... 83

3.3.4. Biểu hiện protein hIL-7 trong cây thuốc lá bằng Agro-infiltration ...... 91

3.4. Đánh giá hoạt tính sinh học của protein hIL-7 tái tổ hợp ........................ 99

Chương 4. BÀN LUẬN............................................................................... 101

4.1. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong E. coli rosetta-gami B............ 101

4.2. Biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong dòng tế bào BY-2, rễ tơ......... 103

4.3. Biểu hiện tạm thời protein hIL-7 tái tổ hợp ở cây thuốc lá.................... 106

4.4. Tăng cường biểu hiện protein ở thực vật với ELP và tinh sạch mITC.. 107

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ..........................................................................109

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 110

TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................... 112

PHỤ LỤC..................................................................................................... 138

iv

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Ký tự Tiếng Anh Tiếng Việt

AIDS

Acquired immunodeficiency

syndrome

Hội chứng suy giảm miễn dịch

mắc phải ở người

A. tumefaciens Agrobacteria tumefaciens

A. rhizogenes Agrobacteria rhizogenes

AS Acetosyringone

bp Base pairs Cặp bazơ

BSA Bovine serum albumin Huyết thanh bò

BY2 Bright yellow 2

Cal Calreticulin

cDNA Complementary DNA ADN bổ sung

CTAB

Cetyl trimethyl

ammonium bromide

Chất hoạt động bề mặt ammonium

bromide

DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic

dNTP Deoxyribo nucleotide triphosphate

DTT Dithiothreitol

E. Coli Escherichia coli

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid Axit ethylenediaminetetraacetic

ELISA

Enzyme-linked

immunosorbent assay

xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên

kết với enzyme

ELP Elastin-like peptide

FDA Food & drug administration

Cục quản lý thực phẩm và dược

phẩm Hoa Kỳ

FGF8b

Fibroblast growth factor 8

isoform b

Yếu tố tăng trưởng nguyên bào

sợi 8 isoform b

hIL-7 Human interleukin 7 Interleukin 7 của người

HEV Hepatitis E virus Virus viêm gan E

HPV Human papilloma virus Virus papilloma ở người

HRP Horseradish peroxidase

IFN Interferon

IL Interleukin

IMAC

Immobilized metal ion affinity

chromatography

Sắc kí ion cố định kim loại

IPTG

Isopropyl β-D-1-

thiogalactopyranoside

kb Kilo base

kDa Kilo danton

LB Luria and Bertani

Môi trường dinh dưỡng nuôi cấy

vi khuẩn theo Luria và Bertani

MHC Major histocompatibility complex Phức hệ phù hợp tổ chức

mITC

Membrane-based inverse transition

cycling

Đảo ngược theo màng

mRNA ARN messenger ARN thông tin

MS Murashige and Skoog

Môi trường dinh dưỡng cơ bản

nuôi cấy mô thực vật theo

Murashige và Skoog

NK cell Natural killer cell tế bào giết tự nhiên

nptII

Neomycin phosphotransferase

II gen

Gen kháng kháng sinh

kanamycine

OD Optical density Mật độ quang

PBS Phosphate buffer saline dung dịch muối đệm phosphate

PBST Phosphate buffer saline + tween 20

PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymerase

PVDF Polyvinylidene difluoride Màng sử dụng trong western blot

Ri - plasmid Hairy root inducing plasmid Plasmid gây bệnh rễ tơ ở thực vật

RNAi RNA interference ARN can thiệp

RNase Ribonuclease phân giải ARN

Rpm Revolutions per minute Vòng/phút

scFv Single-chain variable fragment

SDS Sodium dodecyl sulfate

SDS-PAGE

Sodium dodecyl sulfate

polyacrylamide gel electrophoresis

siRNA small interfering RNA

TAE Tris acetate EDTA

TCR T-cell receptor Thụ thể kháng nguyên tế bào T

T-DNA Transfer DNA Đoạn DNA chuyển

TNF Tumor necrosis factor yếu tố hoại tử khối u

TMB 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine

UV Ultraviolet Tia tử ngoại

vir Virulence region Vùng gây độc

v/v Volume/volume thể tích/thể tích

WPM Woody plant medium

Môi trường nuôi cấy theo

Mccown

WT Wild type Chủng hoang dại

w/v weight/volume khối lượng/thể tích

YEB Yeast extract broth

YMB Yeast malnitol broth

v

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Phân nhóm IL ở người......................................................... 7

Bảng 1.2 Một số cytokine biểu hiện thành công ở tế bào BY2............ 21

Bảng 1.3 Một số cytokine tái tổ hợp biểu hiện ở thực vật ................... 25

Bảng 2.1 Thống kê các trình tự mồi sử dụng trong luận án................. 30

Bảng 2.2 Danh sách kháng sinh sử dụng trong luận án....................... 31

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng LR.................................................... 40

Bảng 2.4 Thành phần gel SDS-PAGE................................................ 49

Bảng 3.1 Xử lý mẫu protein với DTT................................................. 71

Bảng 3.2 Kết quả tạo và chọn dòng tế bào BY2 mang gen hIL-7........ 74

Bảng 3.3 Nồng độ DNA tổng số của 20 dòng tế bào BY2................... 75

Bảng 3.4 Khối lượng tươi và khối lượng khô của một số dòng tếbào BY2. 78

Bảng 3.5 Kết quả chuyển gen pK7WG2D.1/cal/IL7 vào mô lá thuốc

lá trên môi trường chọn lọc.................................................. 84

Bảng 3.6 Kết quả tạo dòng rễ tơ chuyển gen hIL-7............................. 84

Bảng 3.7 Đánh giá khối lượng tươi và khối lượng khô các dòng rễ

tơ chuyển gen hIL-7............................................................ 87

Bảng 3.8 Đánh giá chiều dài một số dòng rễ tơ chuyển gen (cm)........ 89

Bảng 3.9 Hiệu suất thu hồi protein hIL-7 tái tổ hợp bằng phương

pháp mITC.......................................................................... 97

Bảng 3.10 Kết quả hoạt hoá dòng tế bào 2E8 bằng protein hIL-7.......... 99

vi

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Cấu trúc protein hIL-7....................................................................... 11

Hình 1.2 Thụ thể hIL-7.................................................................................... 12

Hình 1.3 Vai trò của hIL-7............................................................................... 15

Hình 1.4 Dòng tế bào thuốc lá BY2 (Nicotiana Bright Yellow 2)..................... 22

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát............................................................... 33

Hình 2.2 Cấu trúc attL1_cal/SacI và HindIII/attL2 trong vector pENTR/cal... 38

Hình 3.1 Sự phân bố tỷ lệ % phù hợp của các nhóm mã bộ ba gen hIL-7 biểu

hiện trong hệ thống thực vật .............................................................. 54

Hình 3.2 Biểu đồ phân bố tần suất sử dụng codon theo chiều dài gen hIL-7

khi biểu hiện trong hệ thống thực vật................................................. 55

Hình 3.3 Trình tự gen hIL-7 trước và sau tối ưu mã di truyền........................... 56

Hình 3.4 Cấu trúc vector pET32c(+)/IL7......................................................... 57

Hình 3.5 Hình ảnh điện di các sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gen

pET32c(+)/IL7................................................................................... 58

Hình 3.6 Cấu trúc vector pENTR221/cal/IL7................................................... 59

Hình 3.7 Hình ảnh điện di các sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gen

pENTR221/cal/IL7............................................................................. 60

Hình 3.8 Kết quả colony PCR pK7WG2D.1/cal/IL7......................................... 62

Hình 3.9 Kết quả cắt pK7WG2D.1/cal/IL7 bằng enzyme SacI và HindIII........ 62

Hình 3.10 Cấu trúc vector pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP................... 63

Hình 3.11 Hình ảnh điện di các sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gen

pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP............................................ 65

Hình 3.12 Kết quả điện di các sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gen

pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP........................................... 66

Hình 3.13 Kết quả kiểm tra vector pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP

bằng enzyme NcoI.............................................................................. 67

Hình 3.14 Kết quả kiểm tra chủng biểu hiện pET32c(+)/IL7/Rosetta................. 69

Hình 3.15 Kết quả kiểm tra khả năng biểu hiện hIL-7 từ vi khuẩn E.coli Rosetta

gami B nuôi ở 37oC và 28oC................................................................ 70

Hình 3.16 Kiểm tra biểu hiện protein hIL-7 pha tan bằng Western blot............... 72

Hình 3.17 Kết quả kiểm tra colony PCR pK7WG2D.1/IL7/Cv58....................... 73

Hình 3.18 Chọn lọc dòng tế bào BY2 sau chuyển gen......................................... 74

Hình 3.19 Kết quả PCR các dòng BY2 chuyển gen bằng IL7_F và IL7_R.......... 76

Hình 3.20 Kết quả PCR các dòng BY2 chuyển gen bằng cặp mồi gen virC......... 77

Hình 3.21 Các dòng tế bào huyền phù BY2 sau 21 ngày nuôi cấy....................... 77

Hình 3.22 Đồ thị sinh trưởng của một số dòng tế bào huyền phù thuốc lá BY2

chuyển gen (theo khối lượng tươi)...................................................... 79

Hình 3.23 Đồ thị sinh trưởng của một số dòng tế bào huyền phù thuốc lá BY2

chuyển gen (theo khối lượng khô)...................................................... 80

Hình 3.24 Kiểm tra sự biểu hiện protein hIL-7 tái tổ hợp trong các dòng tế bào

huyền phù BY2 bằng Western blot..................................................... 82

Hình 3.25 Biểu đồ so sánh hàm lượng hIL-7 tái tổ hợp trong các dòng BY2

chuyển gen.......................................................................................... 83

Hình 3.26 Kết quả quá trình tạo và chọn dòng rễ tơ chuyển gen hIL-7…………. 85

Hình 3.27 Kết quả PCR 5 dòng rễ tơ bằng cặp mồi IL7_F và IL7_R................... 85

Hình 3.28 Đồ thị sinh trưởng của các dòng rễ tơ (tính theo khối lượng tươi)....... 88

Hình 3.29 Đồ thị sinh trưởng của các dòng rễ tơ (tính theo khối lượng khô)........ 88

Hình 3.30 Kết quả biểu hiện protein hIL-7 ở các dòng rễ tơ bằng Western blot... 90

Hình 3.31 Biểu đồ so sánh hàm lượng protein hIL-7 trong 5 dòng rễ tơ chuyển gen 90

Hình 3.32 Kết quả colony PCR bằng cặp mồi IL7_BamHI_F/IL7_BamHI_R........ 91

Hình 3.33 Kết quả cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn NcoI...................................... 92

Hình 3.34 Kiểm tra biểu hiện protein hIL-7 trong lá thuốc lá bằng Western blot...... 94

Hình 3.35 Kết quả tinh sạch và định lượng protein hIL-7 bằng phương pháp IMAC 95

Hình 3.36 Kết quả tinh sạch protein hIL-7 bằng phương pháp mITC......................... 97

Hình 3.37 Kết quả định lượng protein hIL-7 tái tổ hợp bằng Western blot................. 98

Hình 3.38 Khả năng hoạt hóa dòng tế bào 2E8 của protein hIL-7 tái tổ hợp............... 100

1

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của luận án

Interleukin là một nhóm các cytokine tiết và các phân tử tín hiệu được

tìm thấy đầu tiên trong các tế bào bạch cầu, đóng vai trò quan trọng trong hệ

thống miễn dịch. Chức năng của hệ thống miễn dịch ở người phụ thuộc chủ yếu

vào các Interleukin, thiếu hụt interleukin sẽ dẫn đến các bệnh tự miễn và thiếu

hụt miễn dịch.

Interleukin 7 (hIL-7) là một cytokine có vai trò chính trong sự tăng

trưởng của các dòng tế bào B và T [13]. Đây là những dòng tế bào có chức năng

quan trọng trong hệ miễn dịch của con người, cũng là đích tấn công của các

virus, mầm bệnh khi xâm nhập vào cơ thể con người.

Trong y học ngày nay, các protein có hoạt tính sinh học được sử dụng

rộng rãi để làm thuốc điều trị như các loại hormone, enzyme tái tổ hợp... Trước

đây, nguồn nguyên liệu để sản xuất các loại protein này chủ yếu là tách chiết

từ các bộ phận của động vật. Tuy nhiên, do nhu cầu ngày càng cao trong khi

nguồn cung từ động vật rất hạn chế, giá thành lại đắt và dễ nhiễm các mầm

bệnh nguy hiểm cho con người, nên việc nghiên cứu tổng hợp protein tái tổ hợp

được đặt ra một cách cấp thiết.

Trong những thập niên gần đây, với những bước tiến lớn trong lĩnh vực

công nghệ sinh học phân tử, việc tổng hợp protein không còn khó khăn như

trước nhờ phương pháp tổng hợp sinh học. Thực tế hiện nay phương pháp này

đã được áp dụng rộng rãi không những để tổng hợp một số loại protein làm

thuốc như insulin, hormone tăng trưởng v.v…. mà còn để tổng hợp rất nhiều

hợp chất khác trong khi nguồn nguyên liệu hạn chế hoặc con đường tổng hợp

hoá học gặp khó khăn [11].

Hiện nay, biểu hiện protein tái tổ hợp ở thực vật đang được quan tâm

nghiên cứu vì những ưu điểm vượt trội so với các hệ thống biểu hiện khác như