Nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên hemagglutinin (HA) tái tổ hợp của virus cúm A/H5H1 và đánh giá tinh sinh miễn dịch trên gà

1

MỞ ĐẦU

Virus cúm thể độc lực cao (Highly pathogenic avian influenza - HPAI)

H5N1 thuộc type A, họ Orthomyxoviridae, là chủng có khả năng gây tử vong cao

trên 50% gia cầm bị nhiễm. Dịch cúm gia cầm H5N1 đã xuất hiện ở nhiều quốc gia

châu Á, châu Âu, châu Phi và đang thực sự là mối đe dọa nghiêm trọng đối với toàn

cầu. Từ khi dịch cúm gia cầm H5N1 xuất hiện tới nay, thế giới đã có hơn 250 triệu

gia cầm bị tiêu hủy, gây thiệt hại nặng nề về kinh tế cho ngành chăn nuôi. Đặc biệt,

không chỉ gây bệnh trên gia cầm, virus cúm A/H5N1 còn có khả năng lây truyền từ

gia cầm sang người. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế gới, từ tháng 01/2003 đến

tháng 12/2016 đã có 856 trường hợp mắc cúm A/H5N1, trong đó 452 trường hợp tử

vong, chiếm 52,8% (www.wpro.who.int/emerging_diseases/AvianInfluenza/en).

Với độc lực mạnh, khả năng đột biến lớn, số lượng các vật chủ không ngừng tăng

lên, virus H5N1 trở thành mối đe dọa về một đại dịch xảy ra trên toàn cầu. Do đó,

việc nghiên cứu tìm ra biện pháp dự phòng và điều trị virus cúm A/H5N1 là vô

cùng cấp bách.

Dịch cúm gia cầm A/H5N1 bùng phát tại Việt Nam vào cuối năm 2003 ở các

tỉnh phía Bắc, sau đó đã nhanh chóng lan tới hầu hết các tỉnh/thành trong cả nước

chỉ trong một thời gian ngắn, hàng triệu gia cầm bị chết và tiêu hủy gây thiệt hại rất

lớn về mặt kinh tế cho ngành chăn nuôi. Sử dụng vắc xin cho gia cầm được xem là

một trong những biện pháp hữu hiệu nhất để ngăn chặn sự lan truyền của virus cúm

và giảm thiểu những thiệt hại do virus cúm gây ra đối với ngành chăn nuôi. Hai loại

vắc xin thương mại đã được sử dụng rộng rãi trên thế giới để tiêm phòng cho gia

cầm là vắc xin bất hoạt và vắc xin sống nhược độc sử dụng vector virus làm dẫn

truyền. Cúm A/H5N1 vẫn là vấn đề có tính thời sự ở Việt Nam, tuy vắc xin phòng

cúm A/H5N1 đã được ứng dụng hơn 10 năm, nhưng hằng năm dịch bệnh vẫn xảy ra

và hiện nay có nguy cơ các phân type mới (H5N6, H5N2, H7N9) xâm nhập. Virus

cúm gia cầm biến đổi liên tục tạo nên những clade mới nên việc tiếp tục nghiên cứu

để có được công nghệ sản xuất vắc xin hiệu quả hơn, dễ tự động hóa hơn, cho phép

2

thích ứng nhanh với biến thể virus mới là hết sức cần thiết. Các nhà khoa học đang

nỗ lực nghiên cứu tạo ra các loại vắc xin khác như vắc xin dưới đơn vị, vắc xin

DNA, vắc xin sống nhược độc ... để đáp ứng yêu cầu phòng chống dịch cúm gia

cầm một cách triệt để. Việc nghiên cứu sản xuất kháng nguyên HA để tạo vắc xin

dưới đơn vị góp phần đa dạng hóa công nghệ sản xuất vắc xin; không phụ thuộc vào

nguồn cung cấp phôi trứng gà; cho phép phân biệt gia cầm tiêm vắc xin và gia cầm

nhiễm bệnh ngoài môi trường bằng giám sát huyết thanh; có thể sản xuất được trong

một thời gian ngắn, đáp ứng yêu cầu phòng chống dịch bệnh khi có biến chủng xảy

ra. Xuất phát từ yêu cầu và cơ sở khoa học trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên

cứu biểu hiện kháng nguyên hemagglutinin (HA) tái tổ hợp của virus cúm

A/H5N1 và đánh giá tính sinh miễn dịch trên gà” với các mục tiêu:

- Biểu hiện kháng nguyên HA tái tổ hợp của virus cúm A/H5N1.

- Đánh giá tính sinh miễn dịch trên gà của protein HA tái tổ hợp, làm cơ sở

để tạo vắc xin phòng cúm A/H5N1.

Nội dung nghiên cứu của đề tài

(1) Nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên HA trong hệ biểu hiện E. coli BL21.

- Biểu hiện gen ha1, ha1-2 trong tế bào E. coli BL21.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố nhiệt độ, IPTG đến biểu hiện gen.

- Tinh chế và kiểm tra tính kháng nguyên của protein tái tổ hợp.

(2) Nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên HA trong tế bào nấm men P. pastoris.

- Nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên HA dưới dạng dung hợp với Trx có vị

trí cắt của thrombin (T) và enterokinase (E) (Trx-TE-HA).

- Nghiên cứu cải biến mã bộ ba và biểu hiện kháng nguyên HA1 trong nấm

men P. pastoris.

- Nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên HA dưới dạng dung hợp trx không có

trình tự cắt của enterokinase và thrombin.

(3) Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố lên quá trình biểu hiện protein HA tái

tổ hợp; lên men và thu hồi protein HA tái tổ hợp.

(4) Đánh giá tính sinh miễn dịch trên gà của protein HA tái tổ hợp.

3

Đóng góp mới của luận án

Luận án là công trình mới ở Việt Nam nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên

HA tái tổ hợp của virus cúm A/H5N1 trong E. coli và nấm men P. pastoris, làm cơ

sở để tạo vắc xin phòng cúm A/H5N1. Từ các cấu trúc thiết kế biểu hiện gen khác

nhau, với nhiều chủng biểu hiện và điều kiện biểu hiện khác nhau chúng tôi đã

chọn được chủng nấm men P. pastoris SMD1168 biểu hiện TrxHA1. Sản lượng

HA được tổng hợp trong nồi lên men đạt 84 mg/l. Hiệu giá HI trung bình huyết

thanh gà sau 2 tuần gây miễn dịch nhắc lại với 100 g TrxHA1 tái tổ hợp qua

đường tiêm dưới da cổ đạt 7-7,2 log2, hiệu giá HI sau 2 tuần gây miễn dịch nhắc

lại bằng đường nhỏ mắt mũi đạt 6,6 - 7,0 log2. Hiệu giá HI huyết thanh gà gây

miễn dịch với protein HA tái tổ hợp tương đương với hiệu giá HI huyết thanh gà

tiêm vắc xin bất hoạt Re-1.

4

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. TỔNG QUAN VỀ VIRUS CÚM A/H5N1

1.1.1. Cấu trúc virus cúm A

Virus cúm thuộc họ Orthomyxoviridae, gồm 3 type A, B, C trong đó virus

cúm type A có nhiều type huyết thanh khác nhau và chủ yếu gây bệnh cho người,

động vật như chim, gia cầm, lợn... Các hạt virus cúm A (virion) có hình cầu hoặc

hình khối đa diện, đường kính 80 -120 nm, đôi khi cũng có dạng hình sợi, khối

lượng phân tử khoảng 250 triệu Da (Hình 1.1A). Kết quả phân tích thành phần hóa

học của virion cho thấy RNA chiếm khoảng 0,8 - 1,1%, protein chiếm khoảng 70 -

74%; lipid 5 - 8% còn lại là carbonhydrate. Hạt virus có cấu tạo đơn giản gồm vỏ

(capsid), vỏ bọc ngoài (envelope) và lõi là RNA sợi đơn âm. Hệ gen virus cúm A, B có

8 sợi RNA âm (PA, PB1, PB2, HA, NA, M, NP và NS) tổng kích thước khoảng 9 kb

mã hóa cho 15 loại protein khác nhau (Hình 1.1B) (Palese, 2007; Amorij, 2008).

A B

Hình 1.1: Hình thái và cấu trúc virus cúm A

(Nguồn: WHO; Amorij, 2008)

Các đoạn PA, PB1, PB2 mã hóa các enzyme trong phức hợp polymerase

(RNA transcriptase) của virus, có độ dài ổn định và có tính bảo tồn cao. Phân đoạn

HA và NA (neuraminidase) mã hóa cho protein bề mặt của virus. Hai protein này có

tính kháng nguyên đặc trưng cho từng chủng virus cúm A. Đoạn NP mã hóa cho

5

nucleoprotein (NP) - thành phần của phức hệ phiên mã, chịu trách nhiệm vận

chuyển RNA giữa nhân và bào tương tế bào chủ. Phân đoạn M mã hóa cho protein

đệm - matrix protein của virus gồm hai tiểu phần M1 và M2 được tạo ra bởi những

khung đọc mở khác nhau của cùng một phân đoạn RNA. Protein M1 là một protein

nền, thành phần chính của virus có chức năng bao bọc RNA tạo nên phức hợp

ribonucleoprotein và tham gia vào quá trình “nảy chồi” của virus. Protein M2 là

chuỗi polypeptide ngắn, có khối lượng phân tử khoảng 11 kDa, protein M2 đâm

xuyên và nhô ra khỏi vỏ ngoài, chịu trách nhiệm tháo vỏ virus giải phóng hệ gen

virus vào bào tương tế bào chủ trong quá trình xâm nhiễm (Palese, 2007; Bouvier,

2008; Neumann, 2009).

Hiện nay, các nhà khoa học đã phát hiện ra 18 loại kháng nguyên HA (H1-

H18) và 11 loại kháng nguyên NA (N1-N11) (Tong, 2013). Trong lịch sử ghi nhận

chỉ phân type H1, H2, H3 và N1, N2 gây bệnh cho người. Gần đây phân type H5, H7,

H9 cũng gây bệnh cho người với mức độ nguy hiểm hơn (Li, 2015; Bui, 2016). Bệnh

dịch do chủng H5N1 gây ra có khả năng lây lan rất cao ở các động vật lông vũ, gây

chết hàng loạt ở chim và gia cầm (Webster, 2002; Schrauwen, 2014; Webster, 2014).

1.1.2. Chu trình tái bản của virus cúm A

Quá trình xâm nhiễm và nhân lên của virus xảy ra chủ yếu ở các tế bào biểu

mô đường hô hấp, đường tiêu hóa của cơ thể vật chủ (Nicholson, 2003; Palese,

2007; Neumann, 2009; de Graaf, 2014). Các giai đoạn của quá trình xâm nhiễm như

sau (Hình 1.2):

Giai đoạn 1 - giai đoạn hấp phụ: các hạt virus gắn với tế bào chủ thông qua

liên kết giữa các phân tử HA với các thụ thể có chứa nhóm sialic acid trên bề mặt tế

bào chủ. Virus cúm gia cầm gắn đặc hiệu với thụ thể sialic acid α 2-3 galactose

(SAα2-3Gal) còn virus cúm người gắn đặc hiệu với thụ thể sialic acid α 2-6

galactose (SAα2-6Gal) (de Graaf, 2014). Do có tính đặc hiệu với thụ thể nên virus

cúm gia cầm không thể dễ dàng lây nhiễm sang người và ngược lại, hình thành rào

cản loài, thu hẹp khả năng lây nhiễm của virus trên một hoặc một số vật chủ nhất

6

định. Ở một số động vật (như lợn, gà ...) có cả hai loại thụ thể nên có thể bị nhiễm

cả virus cúm gia cầm và virus cúm người (Schrauwen, 2014; Neumann, 2015).

Hình 1.2: Chu trình xâm nhiễm và sao chép của virus cúm A

(Nguồn: Neumann, 2009)

Trong cơ thể vật chủ cảm nhiễm, khả năng bám gắn và gây bệnh của virus

cúm còn tùy thuộc vào từng mô cơ quan. Nhìn chung, virus cúm A có tính thích

ứng lây nhiễm với biểu mô đường hô hấp và gây bệnh chủ yếu ở đường hô hấp (de

Graaf, 2014). Tuy nhiên, khả năng liên kết của virus cúm với tế bào chủ còn phụ

thuộc vào hoạt tính của neuraminidase vì trên niêm mạc đường hô hấp có một lớp

mucin bao phủ, tạo nên một hàng rào mà virus phải xuyên qua để gắn với tế bào.

Lớp mucin này chứa nhiều sialic acid hình thành một mạng lưới có tác dụng ngăn

cản virus bám vào bề mặt tế bào (Sanders, 2010). Nhờ hoạt tính sialidase phân cắt

các nhóm sialic acid mà neuraminidase giúp cho virus có thể tiếp cận với các tế bào

cảm nhiễm bên trong đường hô hấp.

Giai đoạn 2 - xâm nhập tế bào: virus xâm nhập vào tế bào chủ yếu bằng con

đường ẩm bào. Sau khi virus gắn vào tế bào, màng tế bào lõm lại hình thành túi bao

bọc virus. Túi này dần dần khép kín lại, sau đó tách khỏi màng tế bào tạo thành túi

nội bào (endosome). Để tránh bị phân hủy bởi môi trường pH thấp trong endosome,

protein M2 hoạt động mạnh, bơm ion H+

vào trong hạt virus.

7

Giai đoạn 3 - tháo vỏ virus: dòng chảy của các ion H+

từ lòng túi ẩm bào

vào hạt virus làm lớp protein nền M1 bị phá vỡ và tách khỏi phức hợp RNP. Hoạt

động của kênh ion H+

làm thay đổi cấu trúc không gian của HA và bộc lộ các

peptide chịu trách nhiệm hòa tan vỏ, nhờ đó vỏ của virus có thể dung hợp với màng

endosome và giải phóng các phức hợp RNP vào trong bào tương tế bào.

Giai đoạn 4 - tổng hợp RNA và protein virus: Phức hợp RNP được vận

chuyển vào nhân tế bào để phiên mã tạo mRNA. Phân tử mRNA được phiên mã

trong nhân từ các chuỗi RNA sợi đơn (-) của virus khi sử dụng mồi là đoạn 10-13

nucleotide cắt ra từ đầu 5’ của mRNA có gắn mũ của vật chủ, sau đó được gắn đuôi

polyA cũng lấy từ mRNA của tế bào chủ. Enzyme cắt mồi là endonuclease do virus

mang theo. mRNA mới hoàn thiện của virus ra khỏi nhân, vào bào tương để tiến

hành tổng hợp protein. Kết quả của quá trình phiên mã từ 8 đoạn RNA hệ gen tạo ra

được 15 phân tử protein.

Trong nhân tế bào, các RNA hệ gen của virus tổng hợp nên các sợi dương từ

khuôn là sợi âm của hệ gen virus, từ các sợi dương này chúng tổng hợp nên RNA hệ

gen của virus mới nhờ RNA - polymerase. Các sợi này không được adenine hóa

(gắn thêm các adenine) và gắn mũ ở đầu 5’ và 3’, chúng kết hợp với nucleoprotein

(NP) tạo thành phức hợp ribonucleoprotein hoàn chỉnh và được vận chuyển ra tế

bào chất. Đây là đặc điểm khác biệt so với các virus khác (quá trình này xảy ra

trong tế bào chất của vật chủ). Các protein PB1, PB2, PA, NP của virus sau khi

được tổng hợp sẽ được đưa vào nhân tế bào và kết hợp với RNA virus hình thành

các phức hợp RNP, sau đó các phức hợp lại được đưa trở lại bào tương. Các protein

khác (HA, NA, và M2) được glycosyl hóa ở mạng lưới nội chất và phức hệ Golgi

của tế bào.

Giai đoạn 5 - lắp ráp và giải phóng virus khỏi tế bào: sau khi trải qua cải

biến sau dịch mã, các protein HA, NA và M2 được đưa đến màng tế bào chủ và gắn

với lớp lipid kép. Khi mật độ các protein màng đủ lớn thì các phức hợp RNP và

protein M2 cũng tập hợp lại trên màng tế bào. Sau khi cả 8 phân đoạn RNA của hệ

8

gen và các thành phần khác được tập hợp đầy đủ thì các phức hợp RNP, protein vỏ

virus và protein nền M1 được lắp ráp lại với nhau để hình thành các hạt virus thế hệ

mới. Các virus mới hình thành được gắn vào màng tế bào bằng liên kết HA với

nhóm sialic acid màng tế bào. Các hạt virus sau đó được giải phóng theo cơ chế nảy

chồi khỏi màng tế bào nhờ tác dụng cắt nhóm axit sialic của neuraminidase.

1.1.3. Kháng nguyên của virus cúm A/H5N1

1.1.3.1. Kháng nguyên HA

HA là một kháng nguyên bề mặt quan trọng của virus cúm A do phân đoạn

gen ha mã hóa. Ở virus cúm A/H5N1 phân đoạn ha có kích thước 1776 bp, trong đó

vùng mã hóa cho protein H5 khoảng 1698 - 1710 bp tùy thuộc vào từng chủng virus

(Xiong, 2013; Nguyễn Thị Bích Nga, 2011). Về cấu tạo, phân tử HA có dạng

trimer, gồm 3 phân tử protein HA0 (Hình 1.3). Khối lượng của mỗi phân tử HA0 là

70 - 75 kDa. HA0 được chia thành hai tiểu đơn vị HA1 (36 kDa) và HA2 (27 kDa).

Hình 1.3: Mô hình cấu trúc bậc 3 và bậc 4 của hemagglutinin

(Nguồn: Amorij, 2008)

Tiểu phần HA1 kết thúc bằng nhóm amino, chứa một số vị trí gắn gốc

đường, vị trí gắn thụ thể trên tế bào chủ và vị trí quyết định kháng nguyên (Amorij,

2008). Phần lớn cấu trúc bậc hai của HA1 là các phiến β cuộn xoắn lại tạo thành

vùng hình cầu của phân tử HA. Tiểu phần HA2 kết thúc bằng nhóm carboxyl, chứa

Vị trí liên

kết thụ thể

Peptid

dung hợp

Vỏ virus

9

phần xuyên màng và peptit dung hợp màng. Cấu trúc bậc hai của HA2 là các đoạn

xoắn  kết hợp với nhau tạo thành vùng dạng sợi, gắn với vỏ virus. Cấu trúc HA0

được bền vững nhờ cầu nối disulfide giữa tiểu phần HA1 và HA2. Protein HA được

tổng hợp dưới dạng polypeptide HA0 ở mạng lưới nội chất, tại đây chúng tập hợp

lại thành dạng trimer. Sau đó, chúng được vận chuyển tới bề mặt tế bào thông qua

bộ máy Golgi. Tại bề mặt tế bào các enzym protease của tế bào chủ phân cắt HA0

thành HA1 và HA2 (Sriwilaijaroen, 2012).

Vùng nối giữa HA1 và HA2 có chứa một hoặc một số amino acid kiềm tính

chính là vùng phân cắt hai tiểu đơn vị của protein HA0 dưới tác dụng của protease.

Trình tự amino acid vùng phân cắt HA có vai trò quyết định độc lực của virus

(Velkov, 2013). Ở các chủng virus, điển hình là H5N1 thể độc lực cao, chuỗi amino

acid kiềm tính trên vùng phân cắt HA được nhận biết bởi các protease nội bào phổ

biến, giúp virus có thể lây nhiễm và tái bản ở nhiều mô cơ quan khác nhau trong cơ

thể vật chủ và gây nên các triệu chứng toàn thân nặng nề (Perdue, 2000; Luczo,

2015). Ngược lại, vị trí phân cắt giữa hai tiểu phần HA1, HA2 ở các chủng virus thể

độc lực thấp chỉ có 1 amino acid kiềm là Arg và một số amino acid kiềm ở vị trí -3

hoặc - 4 nên chỉ chịu tác dụng của các protease ngoại bào (trypsin-like). Do đó,

virus H5N1 thể độc lực thấp chỉ có thể nhân lên ở các mô cơ quan có các enzym

này như ở đường tiêu hóa và đường hô hấp (Steinhauer, 1999; Gambotto, 2008).

Có khoảng 400 phân tử HA trên bề mặt capsid của một virus. HA có vai trò

quan trọng trong quá trình nhận diện, gắn vào tế bào chủ và khởi động quá trình

xâm nhiễm của virus vào tế bào chủ (Bender, 1999). Sự xâm nhiễm của virus được

khởi đầu bằng sự kết hợp đặc hiệu giữa HA của virus với thụ thể trên bề mặt tế bào

vật chủ, sau đó vỏ virus hòa với màng tế bào và giải phóng RNA hệ gen vào tế bào

vật chủ. Quá trình kết hợp phụ thuộc vào sự phù hợp cấu hình không gian của thụ

thể chứa sialic acid của tế bào đích với vị trí gắn với thụ thể này trên phân tử HA

của virus cúm, quyết định sự xâm nhiễm dễ dàng của virus ở các loài vật chủ khác.

Vị trí amino acid 226 (aa226) của tiểu đơn vị HA1 được xác định là vị trí quyết

định phù hợp gắn HA với thụ thể đặc hiệu của nó. Ở hầu hết các chủng virus cúm A

10

lưu hành trong tự nhiên vị trí này là glycine, thích ứng với thụ thể Gal α-2,3 sialic

acid (chứa sialic acid liên kết với nhóm hydroxyl (4-OH) của galactose ở góc

quay α-2,3) của tế bào biểu mô đường hô hấp của chim và gia cầm (vật chủ tự nhiên

của virus cúm A) (Gamblin, 2010). Ngoài ra, một số vị trí amino acid khác như

glutamine 222, glycine 224, hay cấu trúc SGVSS và NGQSGR cũng có sự liên quan

chặt chẽ đến khả năng thích ứng với thụ thể chứa sialic acid bề mặt màng tế bào chủ

(Schrauwen, 2014; Luczo, 2015).

1.1.3.2. Kháng nguyên NA

Neuraminidase (sialidase), một enzyme có bản chất là glycoprotein được gắn

trên bề mặt capsid của virus cúm A. Gen mã hóa cho protein NA có chiều dài thay

đổi theo từng phân type virus cúm A. Ở virus cúm H5N1, gen na có kích thước thay

đổi trong khoảng 1350–1410 bp (Baigent, 2001; Wagner, 2002; Keawcharoen,

2005; Nguyễn Thị Bích Nga, 2011; Xiong, 2013). NA có khối lượng phân tử

khoảng 53 kDa, có cấu trúc hình nấm, bao gồm một đầu chứa 4 tiểu đơn vị và có

đoạn peptide kị nước cắm sâu vào vỏ virus, 4 tiểu đơn vị tạo thành trung tâm hoạt

động của enzyme. NA còn chứa một chuỗi polypeptide đơn hướng về phía đối diện

với kháng nguyên HA. Chuỗi này gồm 6 amino acid có tính bảo thủ cao, chứa các

amino acid ưa nước (Castrucci, 1993; Shtyrya, 2009).

Enzyme NA cắt đứt liên kết giữa gốc sialic acid của màng tế bào nhiễm với

phân tử carbohydrate của protein HA, giải phóng hạt virus ra khỏi màng tế bào

nhiễm, đẩy nhanh sự lây nhiễm của virus trong cơ thể vật chủ và ngăn cản sự tập

hợp của các hạt virus mới trên màng tế bào. Mặt khác, NA tham gia vào phân cắt

liên kết này trong giai đoạn “hòa màng”, đẩy nhanh quá trình “cởi áo” (uncoating)

giải phóng hệ gen của virus vào trong bào tương tế bào nhiễm, giúp cho quá trình

nhân lên của virus diễn ra nhanh hơn (Wagner, 2002). Ngoài ra, NA còn phân cắt

các liên kết glycoside, giải phóng neuraminic acid làm tan, loãng màng nhầy bề mặt

biểu mô đường hô hấp tạo điều kiện cho virus nhanh chóng tiếp cận tế bào biểu mô

và thoát khỏi các chất ức chế không đặc hiệu. Cùng với vai trò của kháng nguyên

HA, cả 3 khâu tác động trên của NA đều tham gia làm gia tăng độc lực gây bệnh

11

của virus cúm A ở cơ thể vật chủ. Do đó, NA là đích tác động của các thuốc hóa

dược ức chế virus không đặc hiệu hiện nay, ví dụ Oseltamivir (biệt dược là Tamiflu)

phong tỏa enzyme NA, ngăn cản sự giải phóng hạt virus mới khỏi các tế bào đích,

bảo vệ cơ thể (Aoki, 2007).

NA là một kháng nguyên bề mặt của virus, tham gia kích thích hệ thống

miễn dịch của cơ thể chủ, sinh ra kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên NA của các

chủng virus đương nhiễm (Kilbourne, 2004; Rockman, 2013). Tương tự kháng

nguyên HA, hàm lượng kháng nguyên NA trên bề mặt virus khá lớn, tỷ lệ HA:NA

là 4:1. Nghiên cứu ảnh hưởng của kháng nguyên này trong vắc xin phòng cúm trên

mô hình chuột thực nghiệm cho thấy NA không có khả năng bảo hộ hoàn toàn cơ

thể chống lại virus cúm nhưng lại có khả năng hạn chế hữu hiệu sự phát triển của

virus. Vì vậy, kháng nguyên NA được sử dụng như một nhân tố bổ trợ giúp tăng

khả năng bảo vệ của vắc xin (Kilbourne, 2004; Doyle, 2013; Eichelberger, 2015).

1.1.3.3. Kháng nguyên M2

Phân đoạn M có kích thước 1027 bp, mã hóa cho protein nền M1 của virus

và protein kênh ion M2. Hai protein này được mã hóa bởi những khung đọc mở

khác nhau của phân đoạn M. Các phân tử M1 liên kết với nhau thành một lớp kín

lót trong vỏ lipit kép, cùng với HA, NA và M2 hình thành nên vỏ capsid bao bọc

các phức hợp RNP. M2 là một protein xuyên màng bao gồm 97 amino acid với 3

vùng: vùng đầu N gồm 24 amino acid, nằm ở phía ngoài màng; vùng xuyên màng

gồm 19 amino acid; vùng nằm ở phía bào tương gồm 54 amino acid. Khối lượng

phân tử M2 khoảng 15 kDa. Chức năng của protein M2 là tạo kênh ion H+

cần thiết

cho khả năng lây nhiễm của virus ( Holsinger, 1994; Huang, 2008; Wang, 2011). Sự

hình thành nên kênh ion có vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của virus,

tạo điều kiện để virus phá vỡ vỏ endosome, giải phóng RNP vào bào tương tế bào

chủ. Protein M2 là đích của các thuốc kháng virus dòng adamantane (gồm

amantadine và rimantadine). Các thuốc này gắn với protein M2 làm protein mất

chức năng hình thành kênh ion, do đó ngăn chặn quá trình giải phóng RNP vào bào

tương tế bào nhiễm (Arinaminpathy, 2008). Tuy nhiên, một số đột biến thay thế

12

amino acid trên protein M2 của virus H5N1 gây ra hiện tượng kháng adanmatane

như: L261/F; V27/A/I/G; A30/S/T; S31N...(Cheung, 2006; Wang, 2013).

1.1.4. Các phương thức biến đổi kháng nguyên của virus cúm A

1.1.4.1. Hiện tượng lệch kháng nguyên

Lệch kháng nguyên là các đột biến điểm xảy ra ở các phân đoạn gen/hệ gen

của virus. Virus cúm A kí sinh nội bào bắt buộc, không có cơ chế đọc và sửa bản

sao trong quá trình phiên mã và sao chép ở nhân tế bào chủ. Sự thiếu hụt enzyme

sửa chữa dẫn đến các enzyme sao chép phụ thuộc RNA có thể thêm, làm mất hoặc

thay thế một hay nhiều nucleotide trong phân tử RNA chuỗi đơn mới của virus.

Hiện tượng này thường xảy ra ở các phân đoạn HA và NA, gây ra một hoặc một số

thay đổi sau: (1) tạo ra các bộ mã tổng hợp các amino acid mới; (2) làm thay đổi cấu

trúc dẫn đến thay đổi đặc tính của protein đó; (3) làm tăng mức độ glycosyl hóa

trong cấu trúc chuỗi polypeptide kháng nguyên; (4) tạo ra một biến thể virus mới có

độc tính và tính kháng nguyên mới trở thành chủng được chọn lọc trong quần thể do

chúng có khả năng nhiễm vào vật chủ chưa miễn dịch. Tần suất xảy ra đột biến

điểm rất cao, cứ 10.000 nucleotide (tương ứng với độ dài của RNA hệ gen của virus

cúm A) thì có 1 nucleotide bị đột biến (Webster, 1998). Như vậy, gần như mỗi hạt

virus mới được sinh ra đều chứa đựng ít nhất một đột biến điểm trong hệ gen của nó

và các đột biến này được tích lũy qua nhiều thế hệ virus và sẽ làm xuất hiện phân

type mới có những đặc tính kháng nguyên mới (Webster, 1998; Macken, 2006;

Chen, 2008). Trên phân tử HA của virus cúm A/H5N1 có 3 vị trí kháng nguyên

thường xuyên bị đột biến tạo nên các kháng nguyên mới, giúp virus thoát khỏi hệ

miễn dịch của vật chủ đó là các đột biến ở vị trí amino acid 136-141; vị trí amino

acid 152-153 và vị trí amino acid 124-129 (Smirnov, 2004; Hanson, 2016). Hiện

tượng lệch kháng nguyên là nguyên nhân gây ra các đợt dịch nhỏ, tản phát.

1.1.4.2. Hiện tượng trộn kháng nguyên

Hiện tượng trộn kháng nguyên xảy ra khi hai hay nhiều chủng virus cúm A

khác nhau, với nhiều đoạn RNA khác biệt nhau về mặt di truyền cùng lúc xâm

13

nhiễm vào một cơ thể vật chủ. Các phân đoạn gen của virus hoán vị với nhau. Kết

quả là tạo ra biến chủng virus mới có thể lây nhiễm vào vật chủ mới mà bố mẹ

chúng không có khả năng gây nhiễm hoặc gia tăng độc lực gây bệnh. Do đó, trộn

kháng nguyên được coi là nguyên nhân gây ra các đại dịch cúm (Macken, 2006;

Chen, 2008). Các virus HPAI H5N1 ở khu vực Đông Nam Á đều có gen HA và

NA có nguồn gốc từ chủng gốc Gs/Gd/1/96 trong khi 6 gen còn lại được lấy từ các

nguồn khác nhau do hiện tượng trao đổi và tích hợp các phân đoạn gen. Chính

hiện tượng trộn kháng nguyên này đã tạo virus H5N1 gây ra đại dịch ở người năm

1997 và tiếp sau đó các dịch cúm gia cầm năm 2001 và 2002 (Chen, 2008).

Năm 1997, ở Hồng Kông virus cúm A/H5N1 lây trực tiếp từ gà sang người

đã giết chết 6 trên tổng số 18 người bị nhiễm. Virus này tiếp tục lan truyền sang

ngỗng ở miền Nam Trung Quốc và thay thế ngay các kiểu gen khác gây bệnh ở gà

nhưng không gây bệnh ở vịt. Năm 2001, 6 kiểu gen đã được xác định là A, B, C,

D, E và X0. Các kiểu gen này đều giống nhau về đột biến xóa 5 amino acid (vị trí

80-84) của protein NS1, ngoại trừ kiểu gen chủng Gs/Gd/1/96 và kiểu gen X0.

Năm 2002, có 8 kiểu gen mới xuất hiện là V, W, X1, X2, X3, Y, Z và Z+

, trong

khi các chủng A, C, D và E không thấy nữa. Kiểu gen HPAI H5N1 trong giai đoạn

này mang đột biến mất 5 amino acid của NS1 và đột biến mất 20 amino acid (49-

68) trên vùng thân của NA. Đến năm 2003, thêm 3 kiểu hình chính nữa là Y, Z+ và

V được phát hiện. Kiểu gen G được hình thành do sự trao đổi và tích hợp giữa

kiểu gen Z và W năm 2004. Trong số các kiểu gen đã xuất hiện, kiểu gen Z chiếm

ưu thế ở khu vực Đông Nam Á trong suốt giai đoạn từ 2003 đến nay (Chen, 2006).

1.1.4.3. Hiện tượng glycosyl hóa

Glycosyl hóa là sự gắn kết một chuỗi carbonhydrate vào amino acid

asparagine (N) ở một số vị trí nhất định trong chuỗi polypeptide HA hay NA, hay

một số polypeptide khác của virus cúm. Thông thường chuỗi carbohydrate được gắn

tại vị trí asparagine có motif N-X-S/T (N = asparagine; X = amino acid bất kì, trừ

proline; S/T = Serine hoặc Threonine) (Tate, 2014). Nếu hiện tượng lệch kháng