Nghiên cứu biểu hiện gen laccase từ nấm mốc fusarium oxysporum trong nấm men pichia pastoris và đặc điểm enzyme tái tổ hợp

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM



TRƯƠNG THỊ BÉ

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN LACCASE TỪ NẤM MỐC

Fusarium oxysporum TRONG NẤM MEN Pichia pastoris

VÀ ĐẶC ĐIỂM ENZYME TÁI TỔ HỢP

LUẬN VĂN THẠC SĨ

SINH HỌC THỰC NGHIỆM

Đà Nẵng – Năm 2021

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM



TRƯƠNG THỊ BÉ

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN LACCASE TỪ NẤM MỐC

Fusarium oxysporum TRONG NẤM MEN Pichia pastoris

VÀ ĐẶC ĐIỂM ENZYME TÁI TỔ HỢP

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60.42.01.14

LUẬN VĂN THẠC SĨ

SINH HỌC THỰC NGHIỆM

Người hướng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN ĐỨC HUY

Đà Nẵng – Năm 2021

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi.

Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố

trong bất kỳ công trình nào khác.

Tác giả luận văn

Trương Thị Bé

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn “Nghiên cứu biểu hiện gen

laccase từ nấm mốc Fusarium oxysporum trong nấm men Pichia pastoris và đặc điểm

enzyme tái tổ hợp”, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến Ban Giám Hiệu; Phòng Sau đại học;

Khoa Sinh – Môi trường; Hội đồng khoa học trường Đại học Sư phạm Đà Nẵng; các thầy

cô Giảng viên đã nhiệt tình giảng dạy, hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong

suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.

Xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Đức Huy, người đã tận tình

hướng dẫn, chỉ dạy, truyền đạt kiến thức chuyên môn, động viên tôi trong suốt quá trình

nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Ngoài ra tôi cũng cám ơn đến ThS. Nguyễn Mỹ Lệ,

ThS. Đặng Thị Thanh Hà, CN. Lê Thị Kim Thoa cùng các cán bộ tại Phòng thí nghiệm

Công nghệ enzyme và protein, Viện Công nghệ sinh học đã hỗ trợ tôi trong quá trình triển

khai thí nghiệm.

Xin chân thành cảm ơn sự ủng hộ, động viên, giúp đỡ từ phía gia đình và bạn bè và

đồng nghiệp trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

Mặc dù đã rất cố gắng nhưng chắc chắn luận văn không tránh khỏi những sai sót, kính

xin được góp ý và chỉ dẫn thêm.

Xin trân trọng cảm ơn!

Đà Nẵng, 02 tháng 3 năm 2021

Tác giả

Trương Thị Bé

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN LACCASE TỪ NẤM MỐC Fusarium oxysporum

TRONG NẤM MEN Pichia pastoris VÀ ĐẶC ĐIỂM ENZYME TÁI TỔ HỢP

Ngành: Sinh học thực nghiệm

Họ tên học viên: Trương Thị Bé

Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Đức Huy

Cơ sở đào tạo: Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng

Tóm tắt:

1. Những kết quả chính của luận văn

1. Chuyển thành công gen mã hóa laccase 1 (cFolac1) vào P. pastoris. Sự hiện diện

của cFolac1 trong genomic của P. pastoris được kiểm tra khẳng định bằng phản ứng PCR.

2. Laccase tái tổ tợp được tinh sạch từ môi trường nuôi cấy của chủng P. pastoris

tái tổ hợp với khối lượng phân tử khoảng 76 kDa.

3. Chủng P. pastoris tái tổ hợp sinh tổng hợp laccase cao nhất khi được nuôi cấy ở

25oC, tốc độ lắc 210 rpm, mật độ tế bào ban đầu OD600 = 1 với hoạt tính enzyme đạt giá

trị 3552,8 U/L.

4. Laccase tái tổ hợp, có khoảng nhiệt độ tối ưu là 55oC, pH tối ưu là 4,5, ion Cu2+

tăng hoạt tính enzyme trong khi ion Fe2+ ức chế sự hoạt động của laccase.

2. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận văn

Luận văn đã góp phần cung cấp những kết quả khoa học mới về đặc điểm laccase

từ F. oxysporum khi được biểu hiện trong nấm men P. pastoris. Đây là nghiên cứu đầu tiên

trên thế giới công bố kết quả về đặc tính enzyme này. Enzyme tái tổ hợp có thể được sử

dụng cho các mục đích khác nhau như hỗ trợ xử lý nguyên liệu trong sản xuất ethanol sinh

học, xử lý ô nhiễm môi trường do các hợp chất hữu cơ gây ra.

3. Hướng nghiên cứu tiếp theo của đề tài

1. Tối ưu hóa và sản xuất rFolac1 ở quy mô hệ lên men nhằm tăng khả năng sản

xuất enzyme tái tổ hợp.

2. Thử nghiệm ứng dụng laccase tái tổ hợp trong điều kiện phòng thí nghiệm và

thực tế để xử lý nhiều hợp chất gây ô nhiễm như kim loại nặng, các chất kháng sinh (trong

nước thải y tế), các thuốc nhuộm tổng hợp.

4. Từ khóa

Laccase; DNA tái tổ hợp; Fusaryum oxysporum; Pichia pastoris

Xác nhận của GV hướng dẫn Người thực hiện đề tài

TS. Nguyễn Đức Huy Trương Thị Bé

Recombinant expression and characterization laccase from Fusarium

oxysporum in Pichia pastoris

Major: Experimental Biology

Student’s name: Truong Thi Be

Academic advisor: Dr. Nguyen Duc Huy

Training institution: The University of Danang, University of Science and

Education

Summary:

1. The mjor results of study

The study reported the expression and characterization recombinant laccase 1

produced by yeast Pichia pastori.

The recombinant expression of laccase in P. pastoris experiments were carried

out at different conditions, resulting in optimal conditions of temperature of 25oC,

shaking speed of 210 rpm, and cells density of OD600 = 1 produced highest protein

concentration of 0.9 µg/µl with specific activity of 66.538 U/mg.

Recombinant laccase exhibited highest activity at temperature of 55oC, pH of

4.5, Cu2+ increased antivity while Fe2+ inhibited enzyme activity.

2. Scientific and pratical significant of the study

The study provided new founding about recombinant laccase 1 from F.

oxysporum in P. pastoris. This is first report on characterization recombinant laccase

1 from F. oxysporum in P. pastoris. Recombinant enzyme can be able to apply for

material treatment in bioethanol production, environmental pollution by organic

compounds treatment,…

3. Further aspects of study

- Production recombinant enzyme in large scale.

- Purification and performance enzyme structure study.

- Application recombinant enzyme for environmental pollution treatment such

as synthetic dyes.

4. Keywords

Laccase; recombianant DNA; Fusaryum oxysporum; Pichia pastoris

Academic advisor Student

Nguyen Duc Huy Truong Thi Be

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU............................................................................................................................................. 1

1. Tính cấp thiết của đề tài ............................................................................................................ 1

2. Mục tiêu nghiên cứu.................................................................................................................. 3

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU....................................................................................................... 4

1.1. LACCASE.................................................................................................................................. 4

1.1.1. Giới thiệu chung về laccase............................................................................................. 4

1.1.2. Cấu tạo của laccase ......................................................................................................... 4

1.1.4. Đặc tính của laccase ........................................................................................................ 8

1.1.5. Các nguồn thu nhận laccase.......................................................................................... 11

1.1.6. Ứng dụng của laccase.................................................................................................... 14

1.2. HỆ THỐNG BIỂU HIỆN Pichia pastoris................................................................................... 18

1.2.1. Giới thiệu chung về hệ thống P. pastoris ...................................................................... 18

1.2.2. Ưu, nhược điểm của P. pastoris so với các hệ thống biểu hiện khác............................ 19

1.2.3. Hệ thống biểu hiện tái tổ hợp tương đồng sử dụng P. pastoris.................................... 20

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................................................. 26

2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU.................................................................................................... 26

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................................................................................... 26

2.2.1. Phân lập trình tự mã hóa protein từ Folac1 .......................................................................... 26

2.2.1.1. Khuếch đại vùng mã hóa gen laccase ........................................................................ 26

2.2.1.2. Gắn sản phẩm PCR vào vector tạo dòng .................................................................... 27

2.2.1.3. Biến nạp vào E. coli TOP10 và chọn lọc thể biến nạp ................................................. 27

2.2.1.4. Giải mã và phân tích trình tự gen laccase.................................................................. 28

2.2.2. Biểu hiện cFolac1 trong Pichia pastoris............................................................................. 28

2.2.2.1. Tạo dòng trong vector biểu hiện pPICZαA.................................................................. 28

2.2.2.2. Biến nạp vào P. pastoris............................................................................................. 29

2.2.2.3. Biểu hiện gen laccase ................................................................................................. 29

2.2.2.4. Xác định hoạt độ enzyme tái tổ hợp............................................................................... 30

2.2.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự biểu hiện laccase tái tổ hợp ................................ 30

2.2.3.1. Thời gian cảm ứng...................................................................................................... 30

2.2.3.2. Nồng độ chất cảm ứng............................................................................................... 31

2.2.3.3. Mật độ tế bào............................................................................................................. 31

2.2.3.4. Nhiệt độ nuôi cấy........................................................................................................ 31

2.2.3.5. Tốc độ lắc.................................................................................................................... 31

2.2.4. Tinh sạch enzyme tái tổ hợp.............................................................................................. 31

2.2.5. Điện di SDS – PAGE ............................................................................................................ 32

2.2.6. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ laccase tái tổ hợp ................................. 32

2.2.6.1. Ảnh hưởng pH................................................................................................................. 32

2.2.6.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ ................................................................................................. 33

2.2.6.3. Ảnh hưởng của ion kim loại............................................................................................ 33

2.2.7. XỬ LÝ THỐNG KÊ ........................................................................................................... 33

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU................................................................................................... 34

3.1. BIỂU HIỆN GEN LACCASE TRONG Pichia pastoris.................................................................. 34

3.1.1. Tạo dòng cFolac1 vào pGEM®T-Easy và biến nạp vào E. coli Top10.............................. 34

3.1.2. Tạo dòng vào vector biểu hiện pPICZαA .............................................................................. 34

3.2. TỐI ƯU HÓA SỰ BIỂU HIỆN LACCASE TÁI TỔ HỢP ........................................................... 37

3.2.1. Ảnh hưởng của thời gian cảm ứng................................................................................ 37

3.2.2. Ảnh hưởng của mật độ tế bào ................................................................................................ 37

3.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng................................................................................... 39

3.2.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy........................................................................................... 40

3.2.5. Ảnh hưởng của tốc độ lắc ...................................................................................................... 42

3.2.6. Tinh sạch enzyme .......................................................................................................... 43

3.3. Khảo sát đặc điểm enzyme tái tổ hợp.............................................................................. 44

3.3.1. Ảnh hưởng của pH ................................................................................................................. 44

3.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ ......................................................................................................... 45

3.3.3. Ảnh hưởng của ion kim loại ................................................................................................... 46

Chương 4. BÀN LUẬN....................................................................................................................... 48

1. KẾT LUẬN................................................................................................................................. 53

2. KIẾN NGHỊ................................................................................................................................ 53

PHỤ LỤC......................................................................................................................................... 61