Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu vai trò của nhóm gen mã hóa deubiquitinase và một số tín hiệu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

NCS. Đỗ Thị Trang

NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA NHÓM GEN MÃ HÓA

DEUBIQUITINASE VÀ MỘT SỐ TÍN HIỆU PHÂN TỬ TRÊN

BỆNH NHÂN TĂNG HỒNG CẦU VÔ CĂN

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 9 42 02 01

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

1. PGS.TS. Nguyễn Thị Xuân

2. TS. Nguyễn Thị Thanh Ngân

Hà Nội – năm 2022

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan mọi kết quả của luận án: “Nghiên cứu vai trò của nhóm gen

mã hóa deubiquitinase và một số tín hiệu phân tử trên bệnh nhân tăng hồng cầu vô

căn” là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng nghiên cứu, cộng tác với

các cộng sự khác. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một

phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành trong nước và quốc tế

với sự đồng ý của các đồng tác giả khoa học. Bên cạnh đó, những kết quả còn lại trong

luận án cũng chưa được tác giả nào công bố trong bất kỳ công trình khác. Nếu không

đúng như các thông tin đã nêu trên, tôi xin chịu trách nhiệm hoàn toàn về các nội dung

trong luận án của mình.

Hà Nội, ngày tháng năm 2022

Nghiên cứu sinh

Đỗ Thị Trang

ii

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Thị Xuân – Trưởng

Phòng hệ gen học miễn dịch, TS. Nguyễn Thị Thanh Ngân-Phòng Hệ gen học chức

năng, Viện Nghiên .cứu hệ gen, người thầy hướng dẫn tạo mọi điều kiện thuận lợi chia

sẻ, giúp đỡ những khó khăn cùng tôi trong cả quá trình làm việc và hoàn thành luận

văn.

Tôi xin cảm ơn đến Ban lãnh đạo Học viện Khoa học và Công nghệ, bộ phận

đào tạo của Học viện đã luôn hỗ trợ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi học tập và

thực hiện luận án này.

Tôi xin trân trọng cảm ơn Viện trưởng Viện Nghiên cứu hệ gen- GS.TS. Nguyễn

Huy Hoàng và các thầy cô, các anh chị ở Viện đã luôn chỉ bảo, hướng dẫn tận tình

cho tôi trong các môn học cũng như phương pháp thực nghiệm và trình bày kết quả.

Trong thời gian học tập và nghiên cứu tại Viện Nghiên cứu hệ gen, tôi xin gửi

lời cảm ơn chân thành đến các bạn trong Phòng Hệ gen học miễn dịch đã luôn bên

cạnh giúp đỡ và cổ vũ nhiệt tình để tôi hoàn thành tốt các thí nghiệm của mình.

Tôi xin chân thành cảm ơn đề tài Mã số: ĐTĐL.CN-43/21 thuộc Bộ Khoa học

và Công nghệ đã hỗ trợ kinh phí cho tôi trong suốt quá trình học tập.

Với tất cả lòng biết ơn, tôi xin gửi lời tri ân tới bố mẹ,. những người thân trong

gia đình đã luôn ủng hộ, động viên tinh thần tôi trong thời gian hoàn thành tốt luận án

tiến sĩ của mình.

Hà Nội, ngày tháng năm 2022

Nghiên cứu sinh

Đỗ Thị Trang

iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................................i

LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................ii

MỤC LỤC......................................................................................................................iii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN ÁN.............................. vi

DANH MỤC BẢNG....................................................................................................viii

DANH MỤC HÌNH .......................................................................................................ix

MỞ ĐẦU......................................................................................................................... 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU......................................................................... 5

1.1 Giới thiệu về bệnh tăng hồng cầu vô căn.................................................................. 5

1.1.1 Khái quát bệnh tăng hồng cầu vô căn .................................................................... 5

1.1.2 Một số nghiên cứu về kiểu hình miễn dịch trên bệnh tăng hồng cầu vô căn......... 6

1.1.3 Một số nghiên cứu về đột biến gen trên bệnh nhân tăng hồng cầu vô căn ............ 7

1.2 Tế bào đơn nhân máu ngoại vi................................................................................ 10

1.2.1 Khái niệm và đặc điểm sinh học của tế bào đơn nhân máu ngoại vi................... 10

1.2.2 Chức năng của tế bào đơn nhân máu ngoại vi ..................................................... 13

1.2.3 Các marker sinh học liên quan đến quá trình apoptosis....................................... 14

1.2.4 Một số gen kiểm soát miễn dịch .......................................................................... 15

1.2.5 Một số cytokine sử dụng trong nghiên cứu.......................................................... 19

1.2.6 Nghiên cứu sử dụng tế bào đơn nhân máu ngoại vi trên bệnh THCVC.............. 22

1.3 Một số gen thuộc nhóm deubiquitinase và mối liên hệ với các tín hiệu phân tử.... 23

1.3.1 Protein A20 .......................................................................................................... 25

1.3.2 Protein Otubain-1 ................................................................................................. 28

1.3.3 Protein CYLD ...................................................................................................... 31

1.3.4 Protein Cezanne ................................................................................................... 36

1.3.5 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước bệnh tăng hồng cầu vô căn .............. 38

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................ 41

2.1 Vật liệu nghiên cứu ................................................................................................. 41

2.1.1 Đối tượng và tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân....................................................... 41

2.1.2 Dụng cụ, trang thiết bị.......................................................................................... 43

2.1.3 Hóa chất sử dụng.................................................................................................. 43

iv

2.2 Sơ đồ thí nghiệm .....................................................................................................45

2.3 Phương pháp nghiên cứu.........................................................................................46

2.3.1 Xét nghiệm sinh hóa máu.....................................................................................46

2.3.2 Tách huyết tương .................................................................................................47

2.3.3 Tách chiết DNA và RNA .....................................................................................47

2.3.4 Khuếch đại gen (PCR) .........................................................................................48

2.3.5 Giải trình tự gen bằng kỹ thuật Sanger và phân tích dữ liệu ...............................49

2.3.6 Tổng hợp cDNA...................................................................................................51

2.3.7 Real-Time PCR....................................................................................................51

2.3.8 Một số phương pháp tin sinh sử dụng trong luận án............................................53

2.3.9 Đưa siRNA vào trong tế bào đơn nhân máu ngoại vi..........................................54

2.3.10 Phân lập và nuôi cấy tế bào đơn nhân máu ngoại vi..........................................54

2.3.11 Đếm tế bào theo dòng chảy................................................................................57

2.3.12 Xác định sự di cư tế bào.....................................................................................59

2.3.13 ELISA phân tích nồng độ cytokine....................................................................59

2.3.14 Hội đồng đạo đức trong nghiên cứu y sinh........................................................61

CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU....................................................................62

3.1 Kết quả nghiên cứu trên bệnh nhân tăng hồng cầu vô căn .....................................62

3.1.1 Chỉ số sinh hóa máu bệnh nhân tăng hồng cầu vô căn ........................................62

3.1.2 Phân tích sự biểu hiện một số gen deubiquitinase trên bệnh nhân tăng hồng cầu

vô căn ............................................................................................................................63

3.1.3 Mức độ biểu hiện một số gen tín hiệu trên bệnh nhân tăng hồng cầu vô căn......64

3.1.4 Biểu hiện một số gen kiểm soát miễn dịch trên bệnh nhân tăng hồng cầu vô căn

.......................................................................................................................................66

3.1.5 Phân tích đột biến gen JAK2 trên bệnh nhân tăng hồng cầu vô căn ....................67

3.1.6 Phân tích đột biến gen CYLD trên bệnh nhân tăng hồng cầu vô căn ...................69

3.1.7 Phân tích đột biến gen A20 trên bệnh nhân tăng hồng cầu vô căn......................73

3.1.8 Phân tích đột biến gen Cezanne trên bệnh nhân tăng hồng cầu vô căn ..............74

3.1.9 Kiểu hình miễn dịch trên bệnh nhân tăng hồng cầu vô căn .................................77

3.1.10 Sự tiết cytokine và kháng nguyên ung thư ở bệnh nhân tăng hồng cầu vô căn.80

3.2 Kết quả nghiên cứu trên tế bào đơn nhân máu ngoại vi..........................................82

3.2.1 Kết quả phân lập và nuôi cấy tế bào đơn nhân máu ngoại vi ..............................82

v

3.2.2 A20 điều hòa kiểu hình miễn dịch tế bào đơn nhân máu ngoại vi.......................84

3.2.3 A20 điều hòa sự tiết cytokine...............................................................................85

3.2.4 A20 điều hòa sự di cư tế bào đơn nhân máu ngoại vi..........................................86

3.2.5 Protein A20 điều hòa quá trình apoptosis tế bào đơn nhân máu ngoại vi............87

3.2.6 Otubain-1 điều hòa chức năng tế bào đơn nhân máu ngoại vi.............................88

3.2.7 Otubain-1 điều hòa các sản phẩm cytokine ........................................................89

3.2.8 Otubain-1 điều hòa tín hiệu trong tế bào đơn nhân máu ngoại vi........................90

CHƯƠNG 4: THẢO LUẬN .........................................................................................92

4.1 Đa hình và biểu hiện gen deubiquitinase, gen JAK2 và kiểu hình miễn dịch trên

bệnh tăng hồng cầu vô căn............................................................................................92

4.2 Biểu hiện một số gen tín hiệu trên bệnh nhân tăng hồng cầu vô căn......................94

4.3 Vai trò gen A20 điều hòa chức năng tế bào đơn nhân máu ngoại vi.......................95

4.4 Vai trò gen Otubain-1 điều hòa chức năng tế bào đơn nhân máu ngoại vi ............97

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ..............................................................100

5.1 Kết luận .................................................................................................................100

5.2 Kiến nghị...............................................................................................................101

Tài liệu tham khảo.......................................................................................................103

Phụ lục tài liệu...................................................................................................................

vi

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN ÁN

Tên viết

tắt Tên đầy đủ tiếng anh Nghĩa tiếng việt dùng trong luận án

AML Acute myeloid leukemia Bệnh bạch cầu tủy cấp

APC/C Anaphase-Promoting

Complex/Cyclosome

Phức hợp xúc tiến kỳ sau

CA125 Cancer antigen 125

CLL Chronic myeloid leukemia Bệnh bạch cầu lympho mãn tính

CML Chronic myelogenous

leukaemia

Bạch cầu dòng tủy mạn tính

CNL Chronic neutrophilic leukaemia Bạch cầu mạn dòng bạch cầu ái toan

DISC Death-inducing signaling

complex

Chuỗi phản ứng báo hiệu gây chết

DUB Deubiquitinating enzyme

ELISA Enzyme-Linked

Immunosorbent Assay

Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên

kết với enzyme

ET Essential thrombocythaemia Tăng tiểu cầu tiền phát

FISH Fluorescence in situ

hybridization

Kỹ thuật sử dụng lai huỳnh quang tại

chỗ

GM-CSF Granulocyte￾macrophage colony￾stimulating factor

Yếu tố kích thích bạch cầu hạt

HSCs Hematopoietic stem cells Tế bào gốc tạo máu

HWE Hardy-Weinberg equilibrium

IRF Interferon regulatory factor Con đường điều hòa interferon

JAK Janus kinase Janus kinases yếu tố truyền tín hiệu

nội bào

JAK Janus kinase Janus kinases yếu tố truyền tín hiệu

nội bào

MALT1 Mucosa-associated lymphoid

tissue

Mô bạch huyết liên quan đến niêm

mạc 1

MPNs Myeloproliferative neoplasms Tăng sinh tủy ác tính

vii

NF-κB Nuclear factor-κB Yếu tố phiên mã NF-κB

NK Natural .Killer Tế bào diệt tự nhiên

OD Optical Density Đo mức độ hấp thụ quang

PBMC Peripheral blood mononuclear

cell

Tế bào đơn nhân máu ngoại vi

Ph Philadelphia

PM Primary myelofibrosis Xơ tủy nguyên phát

RBC Red blood cell Tế bào hồng cầu

RIP1 Receptor-interacting protein 1

SNP Single nucleotide

polymorphism

Đa hình nucleotide

STAT Signal transducer and activator

of transcription

Yếu tố hoạt hóa phiên mã

TBT Dendritic Cell Tế bào tua

T-CD4+ Helper T cells Tế bào T trợ giúp

T-CD8+ Helper T cells Tế bào T độc

THCVC Polycythemia vera Tăng hồng cầu vô căn

TNFAIP3 Tumor necrosis factor alpha￾induced protein 3

Protein kích thích yếu tố hoại tử khối

u 3

TNF-α Tumor Necrosis Factors alpha Yếu tố hoại tử khối u

TRAF TNF Receptor-Associated

Factors

UV Ultra violet Tia cực tím

WHO World Health Organization Tổ chức Y tế thế giới

viii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Thành phần tế bào trong máu người............................................................. 12

Bảng 1.2. Một số con đường Otubain-1 liên quan........................................................ 31

Bảng 2.1. Các cặp mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR .................................................... 48

Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR........................................................................... 49

Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR giải trình tự....................................................... 50

Bảng 2.4. Trình tự mồi được sử dụng trong nghiên cứu............................................... 52

Bảng 3.1. Tỷ lệ bệnh nhân THCVC có chỉ số xét nghiệm sinh hóa máu cao hơn bình

thường ........................................................................................................................... 62

Bảng 3.2. Sự phân bố kiểu gen của SNP JAK2V617F ở bệnh nhân THCVC và nhóm

chứng............................................................................................................................. 68

Bảng 3.3. So sánh tần số kiểu gen của gen JAK2V617F giữa bệnh nhân THCVC và nhóm

chứng............................................................................................................................. 68

Bảng 3.4. Sự phân bố kiểu gen của các SNP trên gen CYLD ở bệnh nhân THCVC và

nhóm chứng................................................................................................................... 70

Bảng 3.5. So sánh tần số kiểu gen của các gen CYLD giữa bệnh nhân THCVC và

nhóm chứng................................................................................................................... 71

Bảng 3.6. Ảnh hưởng gây bệnh THCVC của SNP c.2483 + 6 T> G. Dự đoán bởi

chương trình phần mềm SD-Score (A) hoặc MaxEntScan (B)..................................... 72

Bảng 3.7. Sự phân bố kiểu gen của các SNP trên gen A20 ở bệnh nhân THCVC và

nhóm chứng................................................................................................................... 74

Bảng 3.8. So sánh tần số kiểu gen của các gen A20 giữa bệnh nhân THCVC và nhóm

chứng............................................................................................................................. 74

Bảng 3.9. SNP của các gen Cezanne ở bệnh nhân THCVC và nhóm chứng .............. 75

Bảng 3.10. So sánh tần số kiểu gen của Cezanne giữa bệnh nhân THCVC và nhóm

chứng............................................................................................................................. 76

Bảng 3.11. Danh sách bệnh nhân tăng hồng cầu vô căn................................................. 1

Bảng 3.12. Danh sách người khỏe .................................................................................. 3

i

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Tế bào ác tính trên bệnh nhân tăng hồng cầu vô căn ...................................... 5

Hình 1.2. Quá trình truyền tín hiệu của protein JAK2 [24] ............................................ 9

Hình 1.3. Các nhóm tế bào máu và tế bào máu ngoại vi [29]....................................... 11

Hình 1.4. Quá trình trưởng thành và biệt hóa của tế bào gốc tạo máu [28].................. 13

Hình 1.5. Các điểm thụ thể kiểm tra miễn dịch và phối tử tương ứng của chúng [38] 16

Hình 1.6. Vai trò của một số gen deubiquitinase [101] ................................................ 26

Hình 1.7. Hoạt động độc lập và phụ thuộc của protein Otubain-1 [118]..................... 29

Hình 2.1. Phân lập tế bào PBMC sử dụng Ficoll.......................................................... 55

Hình 3.1. Mức độ biểu hiện gen của gen DUB ở bệnh nhân THCVC và nhóm chứng 64

Hình 3.2. Mức độ biểu hiện của các gen tín hiệu phân tử STAT................................... 65

Hình 3.3. Biểu hiện gen SHP1 và SHP2 trên bệnh nhân THCVC................................ 65

Hình 3.4. Biểu hiện gen Klotho, LAG3, CTLA4, PD1 trên bệnh nhân THCVC........... 66

Hình 3.9. So sánh trình tự amino acit tại vị trí p.W736G trong protein CYLD ........... 72

Hình 3.10. Điểm đa hình của gen A20 ở bệnh nhân THCVC và nhóm chứng............ 73

Hình 3.11. Điểm đa hình của Cezanne ở bệnh nhân THCVC và nhóm chứng ........... 75

Hình 3.12. Mối liên hệ giữa SNP W736G và 9 SNP khác trong gen CYLD trên bệnh

nhân THCVC ................................................................................................................ 77

Hình 3.13. Hình dot blot của những tế bào CD11b+ và tế bào T CD4 trên bệnh nhân

THCVC. ........................................................................................................................ 78

Hình 3.14. Biểu đồ biểu hiện về tỷ lệ phần trăm các loại tế bào trên bệnh nhân THCVC

so với mẫu đối chứng. ................................................................................................... 78

Hình 3.17. Kết quả đo nồng độ IL-6, TNF-α, IL-1β bằng phương pháp ELISA.......... 81

Hình 3.18. Kết quả đo nồng độ CA125 bằng phương pháp ELISA. ............................ 82

Hình 3.19. Phân lập PBMC bằng phương pháp ly tâm phân lớp theo tỷ trọng. ........... 83

Hình 3.20. Tế bào PBMC được quan sát dưới kính hiển vi (40x)................................ 83

Hình 3.21. Kiểu hình miễn dịch của PBMC khi bất hoạt gen A20Error! Bookmark not defined.

Hình 3.22. Kết quả giải phóng các cytokine từ PBMC được bất hoạt gen A20. .......... 85

Hình 3.23. Sự di chuyển của tế bào PBMC khi được bất hoạt gen A20....................... 86

Hình 3.24. Phân tích khả năng sống sót của PBMC dưới ảnh hưởng của gen A20...... 87

Hình 3.25. Ảnh hưởng của Otubain-1 đến hoạt động và sự chết apoptosis của PBMC.88

Hình 3.26. Kết quả giải phóng các cytokine từ tế bào PBMC bất hoạt gen Otubain-1.90

Hình 3.27. Ảnh hưởng của Otubain-1 đến con đường tín hiệu trong PBMC.............. 91

1

MỞ ĐẦU

Bệnh đa hồng cầu hay bệnh tăng hồng cầu vô căn (THCVC) là một trong những

bệnh tăng sinh tủy dòng ác tính (Myeloproliferative neoplasms - MPNs) không xảy ra

hiện tượng trao đổi đoạn trên nhiễm sắc thể -Philadelphia, đặc trưng bởi sự biến đổi

bất thường của các tế bào gốc tủy xương sinh máu, gây ra sự tăng sinh đột biến các tế

bào máu như bạch cầu, hồng cầu và tiểu cầu, đặc biệt là sự gia tăng về số lượng hồng

cầu. Lượng tế bào hồng cầu cao bất thường dẫn đến giảm tốc độ lưu thông trong mạch

máu, tăng nguy cơ đông máu. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra đột biến V617F thuộc gen

JAK2 (rs77375493) chịu trách nhiệm cho phần lớn số ca mắc phải căn bệnh trên và

gây tăng khả năng phosphoryl hóa của JAK2. Hơn 90% trường hợp bệnh nhân đa hồng

cầu có liên quan đến đột biến này. Nguyên nhân khác dẫn đến THCVC có thể là do

biểu hiện bất thường của một số gen chức năng và gen tín hiệu ảnh hưởng đến hoạt

động sinh học của các tế bào miễn dịch. Đến nay nguyên nhân của bệnh THCVC vẫn

chưa được xác định rõ ràng cụ thể.

Tế bào đơn nhân máu ngoại vi (PBMC- Peripheral blood mononuclear cells)

bao gồm nhiều loại tế bào miễn dịch khác nhau như: tế bào lympho, tế bào NK, tế bào

tua và bạch cầu đơn nhân. Tế bào PBMC có chức năng chuyên biệt cao, đóng vai trò

quan trọng trong hệ miễn dịch giúp cơ thể chống lại những tác nhân bên ngoài và giữ

cho cơ thể khỏe mạnh. Các nhà khoa học hiện nay đã nghiên cứu và sử dụng liệu pháp

miễn dịch tế bào tua (TBT) cho điều trị một số bệnh ung thư như: ung thư tuyến mật,

ung thư tuyến tụy, ung thư buồng trứng và ung thư phổi đã đạt được thành công nhất

định. Liệu pháp tế bào diệt tự nhiên (NK) đang nổi lên như một lĩnh vực nghiên cứu

đầy hứa hẹn, một số nhóm nghiên cứu đã xác nhận về thuốc kháng u hoạt động của tế

bào NK ở bệnh nhân bạch cầu tủy cấp. Vai trò của tế bào T điều hòa cũng được nghiên

cứu trong quá trình sinh bệnh và điều trị ung thư tuyến tiền liệt. Nhiều nghiên cứu đã

báo cáo rằng hoạt động của tế bào T điều hòa có liên quan trực tiếp đến các bệnh khác

nhau như nhiễm trùng mãn tính và ung thư.

Nhóm gen mã hóa deubiquitinase (DUB) bao gồm các gen A20, Otubain-1,

CYLD, Cezanne đóng vai trò quan trọng trong việc khử protein bằng cách phân cắt

chuỗi polyubiquitin của chúng. Vai trò của nhóm gen DUB rất đa dạng, ngoài chức

năng khử nó còn tham gia điều hòa sự phát triển của khối u và đóng vai trò quan trọng

trong quá trình tạo máu, tạo hồng cầu và các bất thường liên quan. Chuột bất hoạt gen

2

A20 và CYLD làm tăng biểu hiện hoạt động các tín hiệu phân tử như NF-κB và STAT.

Nghiên cứu về miễn dịch đã chỉ ra rằng, gen A20 và CYLD tham gia ngăn chặn phản

ứng viêm và sự xâm nhập của bạch cầu tới vị trí viêm, do đó chúng liên quan đến sự

phát triển các bệnh ung thư. Tương tự như gen A20 và CYLD, gen Cezanne ức chế tín

hiệu NF-κB bằng cách liên kết chuỗi K63-polyubiquitin và sự bất hoạt Cezanne có liên

quan đến sự tiến triển và tiên lượng xấu trong ung thư biểu mô tế bào gan. Cezanne

cũng tham gia làm tăng sự tiến triển của khối u trong ung thư biểu mô vảy phổi và ung

thư biểu mô tuyến. Gen Otubain-1 mã hóa cho protein khối u buồng trứng Otubain-1,

nó tham gia tách chuỗi ubiquitin từ phân tử TRAF (TNF Receptor-Associated

Factors). Otubain-1 đóng vai trò quan trọng trong sự khởi đầu và phát triển ung thư.

Gần đây, vai trò của Otubain-1 trong điều hòa một số con đường liên quan đến ung thư

cũng bắt đầu được nghiên cứu rộng rãi. Một số nghiên cứu chứng minh rằng, Otubain￾1 tham gia vào điều hòa các quá trình apoptosis, kháng trị liệu, tăng sinh, di cư và xâm

lấn ở một số loại ung thư.

Đề tài sử dụng tế bào đơn nhân máu ngoại vi PBMC từ người tình nguyện hiến

máu khỏe mạnh và bệnh nhân tăng hồng cầu vô căn để xác định biểu hiện/ đa hình của

nhóm gen DUB, kiểu hình miễn dịch và một số tín hiệu phân tử liên quan cùng với

việc xác định chức năng của một số gen như gen Otubain-1 và gen A20 tham gia điều

hòa hoạt động tế bào PBMC, từ đó góp phần hiểu biết hơn về ảnh hưởng của nhóm

gen DUB trên, ứng dụng trong phối hợp chẩn đoán và điều trị bệnh THCVC và một số

bệnh máu ác tính khác.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chỉ ra rằng bệnh nhân THCVC có các gen

DUB bao gồm gen A20, CYLD và Cezeanne biểu hiện bất hoạt và nồng độ các

cytokines IL6, TNF- α tăng cao cũng như tăng số lượng tế bào CD25+ CD4 T, Th1 và

tế bào T điều hòa trong máu tuần hoàn. Phân tích di truyền của gen CYLD đã xác định

được 11 SNP, trong đó có SNP W736G chưa được biết đến trước đó, SNP này thuộc

exon 15 và có nhiều khả năng gây bệnh. Kết quả của nghiên cứu đóng góp quan trọng

hiểu biết thêm về thành phần của tế bào miễn dịch thay đổi trong máu tuần hoàn của

bệnh nhân THCVC, đặc biệt là số lượng tế bào T điều hòa tăng cao là một bất lợi cho

đáp ứng miễn dịch của bệnh nhân. Sự thay đổi thành phần các loại tế bào miễn dịch,

có thể là kết quả từ ảnh hưởng không nhỏ của các gen chức năng điều hòa hoạt động tế

bào miễn dịch như gen A20, CYLD và Cezanne khi biểu hiện của chúng thấp hơn so

3

với bình thường. Những gen này tham gia ức chế phản ứng viêm và ngăn chặn hoạt

động quá mức của tế bào miễn dịch. Vì thế, biểu hiện của những gen này bị bất hoạt có

thể là một trong những nguyên nhân gây ra số lượng tăng của các loại tế bào CD4 T,

Th1 và T điều hòa trong máu tuần hoàn bệnh nhân. Dựa vào kết quả nghiên cứu này,

chúng tôi có cơ sở khoa học để có những nghiên cứu sâu hơn về cơ chế điều hòa của

các gen DUB, đặc biệt là gen CYLD, đến hoạt động hệ miễn dịch của bệnh nhân

THCVC, từ đó có thể tiến tới nghiên cứu ứng dụng trong điều trị kết hợp với điều trị

gen đích bệnh nhân THCVC.

Luận án được thực hiện với các mục tiêu như sau:

1. Xác định vai trò của gen A20 và gen Otubain-1 điều hòa chức năng sinh học

tế bào PBMC bao gồm sự thuần thục, sự biệt hóa và sự chết apoptosis.

2. Xác định mức độ biểu hiện mRNA/đa hình của một số gen mã hóa

deubiquitinase, gen tín hiệu liên quan và kiểu hình miễn dịch trên bệnh nhân THCVC

và người khỏe mạnh.

Nội dung nghiên cứu của luận án:

Đối tượng nghiên cứu là 77 bệnh nhân THCVC và 55 mẫu người khỏe mạnh,

sử dụng phương pháp real-time PCR xác định mức độ biểu hiện gen thuộc nhóm DUB

bao gồm (A20, Otubain-1, Otubain-2, CYLD, Cezanne), gen kiểm soát miễn dịch

(Klotho, LAG3, CTLA4 và PD1) và gen tín hiệu phân tử liên quan SHP-1, SHP-2, IkB￾α, STAT-1, STAT-3, STAT-5, STAT-6. Một số gen DUB được xác định có biểu hiện bất

thường được kiểm tra lại bằng phương pháp giải trình tự Sanger nhằm xác định các đa

hình/biến thể gen trên bệnh nhân THCVC. Phân tích kiểu hình miễn dịch của bệnh

nhân THCVC bằng cách sử dụng phương pháp đếm tế bào dòng chảy và ELISA.

Tế bào PBMC được phân lập bằng phương pháp ly tâm tỷ trọng Ficoll từ 150ml

mẫu máu của người tình nguyện hiến máu. Xử lý tế bào PBMC với siRNA-A20 và

siRNA-Otubain-1 để bất hoạt 2 gen A20 và Otubain-1, từ đó xác định vai trò của hai

gen này điều hòa chức năng sinh học của tế bào PBMC bao gồm sự thuần thục, sự biệt

hóa, tiết cytokine, di cư và sự chết apoptosis và các tín hiệu phân tử liên quan. Tế bào

sau khi xử lý được tách RNA và chuyển cDNA sau đó tiến hành kiểm tra mức độ biểu

hiện của các gen tín hiệu phân tử liên quan bao gồm (SHP-1, SHP-2, IkB-α, STAT-1,

STAT-3, STAT-5, STAT-6). Dịch huyền phù thu được dùng để kiểm tra nồng độ các

cytokine bằng phương pháp ELISA. Hoạt động sinh lý của tế bào PBMC thay đổi dưới