Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu sự phát sinh phôi soma từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào lá cây cọc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNN

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

ĐỖ ĐĂNG GIÁP

NGHIÊN CỨU SỰ PHÁT SINH PHÔI SOMA TỪ NUÔI CẤY

LỚP MỎNG TẾ BÀO LÁ CÂY CỌC RÀO (Jatropha curcas L.)

VÀ ỨNG DỤNG TRONG VI NHÂN GIỐNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

TP. HỒ CHÍ MINH – Năm 2016

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNN

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

ĐỖ ĐĂNG GIÁP

NGHIÊN CỨU SỰ PHÁT SINH PHÔI SOMA TỪ NUÔI CẤY

LỚP MỎNG TẾ BÀO LÁ CÂY CỌC RÀO (Jatropha curcas L.)

VÀ ỨNG DỤNG TRONG VI NHÂN GIỐNG

Chuyên ngành: Di truyền và chọn giống cây trồng

Mã số: 62 62 01 11

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:

TS. THÁI XUÂN DU

TS. NGUYỄN ĐÌNH LÂM

TP. HỒ CHÍ MINH – Năm 2016

1

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài

Vi c ng d ng c ng ngh sinh học sản xuất nhi n li u sinh học th y th nguồn

nhi n li u hó thạch ng ngày càng cạn ki t như hi n n y là một vấn ề áng qu n

tâm. Theo các tài li u nghi n c u và thực t sử d ng ở nhiều nước tr n th giới, nhi n

li u sinh học chủ y u gồm: eth nol sinh học và diesel sinh học. Eth nol sinh học có th

sản xuất từ nhiều nguồn nguy n li u khác nh u như sắn, mí , ng , ậu tương, mỡ cá,

còn diesel sinh học có th sản xuất từ các cây cọc rào, cọ dầu, hoàng li n mộc, văn

quan, bánh dầu, dừa.

Vi t N m, vi c sản xuất eth nol có nh ng hạn ch nhất nh. Di n tích ất n ng

nghi p hạn hẹp n n khả năng mở rộng di n tích trồng cây nguy n li u có nhiều khó

khăn, các cây nguy n li u cho sản xuất eth nol sinh học ều là nh ng cây lương thực

chủ y u, cây làm th c ăn chăn nu i có li n qu n n n ninh lương thực cần phải xem

xét c n trọng. Hơn n , sự phát tri n mạnh củ vi c trồng cây sắn tr n ất dốc s gây r

xói mòn ất (bồi lấp cử s ng, lòng hồ ập...). Cho n n, vi c nh hướng phát tri n

diesel sinh học s có nhiều thuận lợi hơn. Trong số nh ng loài cây có khả năng sản xuất

diesel sinh học thì cây cọc rào ược chú ý hơn cả do dễ trồng, bi n ộ sinh thái rộng,

khả năng chống ch u tốt và hàm lượng dầu trong hạt khá c o.

Chương trình phát tri n nhi n li u sinh học nói chung và cây cọc rào nói ri ng

nhận ược sự ủng hộ mạnh m củ Nhà nước. Ngày 20 tháng 11 năm 2007, Thủ

Tướng Chính Phủ r quy t nh số 177/2007/QĐ ˗ TTg về vi c ph duy t “Đề án

phát tri n nhi n li u sinh học n năm 2015, tầm nhìn n năm 2025”. Ngày 19 tháng

6 năm 2008, Bộ N ng nghi p và Phát tri n N ng th n r quy t nh số

1842/QĐ˗BNN˗LN về vi c ph duy t ề án “Nghi n c u, phát tri n và sử d ng sản

ph m cây cọc rào (Jatropha curcas L.) ở Vi t N m gi i oạn 2008 ˗ 2015 và tầm nhìn

n 2025”.

Hi n n y, cây giống cọc rào ược dùng phát tri n vùng nguy n li u chủ y u

ược gieo từ hạt và cành giâm. M i phương th c sản xuất giống ều có ưu và nhược

i m nhất nh. Cây giống ược gieo từ hạt có giá thành thấp nhưng b phân ly do cọc

rào là cây th phấn chéo nên khó ki m soát ược năng suất. Cây giống ược sản xuất

2

từ cành giâm cũng kh ng ảm bảo tính ồng nhất về mặt di truyền. Vì vậy, xu hướng

gần ây, các nhà kho học nghi n c u nhân giống theo quy trình kỹ thuật cơ bản như

s u: (1) Nhân giống in vitro một số cây ầu dòng tốt ược tuy n chọn. Nguy n li u

nu i cấy b n ầu có th là ỉnh sinh trưởng, chồi ngọn, chồi nách; (2) Trồng nh ng

cây cấy m r ồng ruộng; (3) Chọn lọc lại và nhân giống bằng kỹ thuật nu i cấy ph i

som từ nh ng cây nu i cấy m nói tr n tăng h số nhân giống và làm hạ giá thành

cây giống.

Phương pháp nu i cấy lớp mỏng t bào là một phương pháp mới, nghi n c u về

khả năng bi t hó củ t bào. H thống t bào lớp mỏng với ặc tính mỏng có nhiều ưu

i m qu n trọng tái thi t lập chương trình cho vi c tạo ph i som . Sự thuận lợi củ

phương pháp nghi n c u lớp mỏng t bào là: tần số phát sinh cơ qu n c o, th i gi n

cho k t quả ngắn. N u chọn ược m i trư ng dinh dưỡng và nồng ộ chất iều hò

sinh trưởng thích hợp thì hầu như 100% mẫu cấy có phản ng. Phương pháp nu i cấy

lớp mỏng t bào cũng là một phương pháp mới, nghi n c u về khả năng bi t hó củ

t bào.

Chỉ th phân tử ược phát tri n và ng d ng từ ầu thập ni n 90 củ th kỷ XX.

Sự phát tri n và ng d ng củ chỉ th phân tử xác nh và sử d ng nh ng bi n ổi

củ DNA là một bước phát tri n qu n trọng nhất trong lĩnh vực di truyền chọn giống

thực vật. Cho n n y, nhiều loại chỉ th phân tử ược phát tri n và ư vào sử d ng.

M i loại chỉ th ều có nguy n lý, kỹ thuật, phạm vi ng d ng khác nh u và phù hợp

cho từng m c ích nghi n c u khác nh u. Trong số các chỉ th phân tử, RAPD ược

xem là kỹ thuật tương ối ơn giản và r tiền, ược ng d ng trong nghi n c u về tính

ổn nh di truyền củ cây giống nu i cấy m . Trong phạm vi nghi n c u củ luận án,

kỹ thuật RAPD ược sử d ng ánh giá ki m tr tính ổn nh di truyền củ cây con

cọc rào từ quy trình vi nhân giống.

Từ nh ng vấn ề n u tr n, luận án: “Nghiên cứu sự phát sinh phôi soma từ

nuôi cấy lớp mỏng tế bào lá cây cọc rào (Jatropha curcas L.) và ứng dụng trong vi

nhân giống” ược thực hi n nhằm ư r một phương pháp mới vi nhân giống hi u

quả số lượng lớn cây cọc rào chất lượng c o, ổn nh về mặt di truyền so với cây ầu

dòng.

3

2. Mục tiêu

- Nghi n c u sự phát sinh ph i som từ nu i cấy lớp mỏng t bào lá cây cọc rào.

- Xây dựng ược quy trình vi nhân giống hi u quả từ nu i cấy ph i som .

- Đánh giá m c ộ ổn nh di truyền ở cây cọc rào vi nhân giống tạo thành bởi

ph i som ược cảm ng từ m sẹo nu i cấy bằng kỹ thuật lớp mỏng t bào lá

làm cơ sở cho vi c sản xuất cây giống in vitro.

3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu

Luận án nghi n c u tr n ối tượng cây cọc rào giống Ấn Độ. Giống này ược

nhập nội và khảo nghi m từ ề tài: “Nghiên cứu tuyển chọn giống và công nghệ trồng

cây dầu mè Jatropha curcas L. để sản xuất diesel sinh học góp phần giảm thiểu ô

nhiễm môi trường thành phố” ược thực hi n do B n quản lý Khu N ng nghi p

C ng ngh c o thành phố Hồ Chí Minh chủ trì từ năm 2007 - 2010. Lá củ nh ng cây

cọc rào trưởng thành ược thu nhận và sử d ng làm vật li u trong nghi n c u.

Phạm vi nghi n c u:

+ Sử d ng nh ng phương pháp nu i cấy m t bào thực vật trong xây dựng quy

trình vi nhân giống cây cọc rào từ ph i som ,

+ Sử d ng nh ng c ng c hi n ại trong ánh giá m c ộ ổn nh di truyền ở cây

giống từ ph i som ,

+ Sử d ng nh ng phương pháp giải phẫu m t bào thực vật và qu n sát hình thái

trong nghi n c u phát sinh hình thái.

4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

a. Ý nghĩa khoa học:

- Đây là một hướng nghi n c u mới trong nu i cấy in vitro tại Vi t N m tr n ối

tượng cây cọc rào.

- Đề tài óng góp một số k t quả nghi n c u về phát sinh hình thái, di truyền chọn

giống cũng như vi nhân giống cây thân g .

b. Ý nghĩa thực tiễn:

- Từ quy trình vi nhân giống củ luận án có th sản xuất cây giống cọc rào ổn nh

về mặt di truyền, có năng suất và hàm lượng dầu c o áp ng nhu cầu củ x hội.

- Một số cá nhân, cơ qu n có nhu cầu nghi n c u có th sử d ng th m khảo quy

trình c ng ngh vi nhân giống cây cọc rào từ k t quả củ luận án.

4

- Một số cơ qu n nghi n c u, do nh nghi p cần ược chuy n gi o quy trình c ng

ngh vi nhân giống cây cọc rào từ k t quả củ luận án.

5. Những đóng góp mới của luận án

Luận án xây dựng ược quy trình vi nhân giống từ ph i som cây cọc rào

th ng qu kỹ thuật nu i cấy lớp mỏng t bào lá. Quy trình ảm bảo các m c ti u có

hi u suất nhân giống c o, ổn nh di truyền, chất lượng tốt. Đây là quy trình ược xây

dựng ầu ti n ở Vi t N m và có một vài i m cải ti n so với nh ng k t quả nghi n c u

tr n th giới.

Trong luận án này, các chất iều hò sinh trưởng thực vật ngoại sinh ược th y

th bằng một số cid mine và poly mine trong một số gi i oạn củ quá trình phát

sinh ph i som tr n cây cọc rào. Đây có th ược xem là tính mới củ luận án so với

nh ng k t quả nghi n c u trước ây.

K t quả củ luận án là tiền ề trong nh ng nghi n c u chuy n gen m c ti u vào

cây cọc rào.

5

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ

CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI

1.1. Tổng quan về cây cọc rào

1.1.1. Vị trí phân loại

Giới (regnum) : Plantae

Ngành (divisio) : Embryophyt (thực vật có ph i)

Lớp (class) : Sperm topsid (thực vật có hạt)

Bộ (ordo) : M lpighi les (bộ sơ ri)

Họ (f mili ) : Euphorbiaceae (thầu dầu)

Chi (genus) : Jatropha (dầu mè, cọc rào)

Loài (species) : Jatropha curcas Linn

T n ti ng Anh : Physic nut

T n ti ng Vi t : Dầu mè, cọc rào, dầu l i …[6]

Tên Jatropha có nguồn gốc từ ti ng Hy Lạp, ghép từ hai ch Jatros (bác sĩ) và

Trophe (th c ăn) ám chỉ công d ng làm thuốc củ cây này. Curc s là t n thư ng gọi

của cây cọc rào ở Malabar, Ấn Độ. Tên thông d ng ở các nước hi n nay là Jatropha.

Vi t Nam, tùy theo từng phương, cây này cũng có nh ng tên gọi khác nh u như:

Cọc giậu, ậu cọc rào, cọc rào, cây li, dầu mè (Võ Văn Chi, 1999; Nguyễn C ng Tạn,

2008) [6], [13].

1.1.2. Nguồn gốc và phân bố

Cọc rào (Jatropha curcas L.) có l ch sử hơn 70 tri u năm, nguồn gốc từ Mexico

(nơi duy nhất có hóa thạch của cây này) và Trung Mỹ, ược ngư i Bồ Đào Nh ư

n ảo Cape Verde, rồi lan truyền s ng Châu Phi, Châu Á, s u ó ược trồng ở nhiều

nước và dần trở thành cây bản a ở hầu khắp các nước nhi t ới, cận nhi t ới trên

toàn th giới. Hi n nay, cây cọc rào ược trồng ở nhiều nước như: Ấn Độ, Indonesia,

Philippine, Trung Quốc, Vi t Nam, một số ảo ở Thái Bình Dương và Úc nhằm ph c

v nhu cầu năng lượng tại ch và xuất kh u (Lele, 2006; Nguyễn C ng Tạn, 2008)

[111], [13].

6

Vi t Nam, cây cọc rào có mặt từ rất sớm (từ trước th kỷ XIV) và cho n

n y ược trồng rải rác ở nhiều phương: Đ c Trọng, Bắc Ninh, Lạng Sơn, Ninh

Thuận, Bình Thuận, Th nh Hó , Lào C i, Đồng Nai và Thành phố Hồ Chí Minh

(Nguyễn C ng Tạn, 2008) [13].

1.1.3. Đặc điểm sinh học

1.1.3.1. Đặc điểm hình thái

Cọc rào là cây b i g mềm, vỏ xám nhẵn. Cây thư ng cao khoảng 3 ˗ 5 m với tán

cây rộng, vòng i tr n 50 năm. Trong iều ki n chăm sóc tốt, cây có th cao từ 8 ˗ 10

m và có th sống lâu hơn. Cành non mập và mọng nước, nhựa cây có màu trắng s a

hay màu vàng nhạt. Cây rậm lá, lá to bản có màu xanh hoặc xanh nhạt, hình ovan hoặc

hình trái tim, có lá ch 3 n 5 thùy. Lá sắp x p xen k nhau, 3 ˗ 5 lá ối x ng nhau

xoắn ốc quanh tr c (Lele, 2006; Nguyễn C ng Tạn, 2008) [111], [13].

Hoa cọc rào mọc thành c m ở ngọn h y nách lá, cây thư ng ra hoa vào mùa hè

khoảng tháng 4 ˗ 9 hàng năm. Ho có kích thước nhỏ, màu vàng và có mùi thơm. Ho

ực mọc ở ầu các nhánh với cuống ngắn có khuỷu, hoa cái mọc ở gi a nh ng nhánh

với nh ng cuống không khuỷu, ho lưỡng tính i khi cũng xuất hi n. Số lượng hoa

ực thư ng nhiều hơn ho cái. Ho ực có 10 nh ược chia thành 2 vòng riêng bi t: 5

nh ở vòng trong dính vào phần chân , 5 nh ở vòng ngoài k t lại thành bó. Hoa cái

thư ng r i rạc với bầu nh y hình elip có 3 noãn với ầu núm nh y ch i (Lele,

2006; Nguyễn C ng Tạn, 2008) [111], [13].

Quả mọc thành chùm và có dạng n ng, kích thước (2,5 ˗ 4,0) cm. Quả chia thành

3 ngăn có ch a hạt. Hạt chín có màu en, thu n dài, kích thước (2 × 1) cm, khối lượng

khoảng 5,8 g (Lele, 2006; Nguyễn C ng Tạn, 2008) [111], [13].

1.1.3.2. Đặc điểm sinh thái

Cọc rào là loài cây có khả năng thích nghi c o. Khi gặp hạn hán, cây thích ng

bằng cách r ng hầu h t lá làm giảm sự thoát hơi nước. Cây có th trồng trên mọi

loại ất. Cây cũng có khả năng ch u ược sương mù nhẹ nhưng chỉ trong th i gian

ngắn. Cây càng già khả năng ch u ựng càng tốt. Tr i lạnh cũng làm cây r ng lá. Nhi t

ộ thích hợp cho cây là 18,0 ˗ 28,5°C. Điều ki n hạt nảy mầm là khí hậu nóng m.

Th i gian ra quả trong vòng 6 tháng n 1 năm và có th kh i thác trong khoảng th i

gian ít nhất 40 năm (Lele, 2006; Nguyễn C ng Tạn, 2008) [111], [13].

7

Nhu cầu nước của cây cọc rào rất thấp. Cây có th tồn tại ược với lượng mư

trung bình năm từ 250 n 350 mm. Vào nh ng tháng mù ng, cây cọc rào r ng lá

hình thành lớp che phủ b n dưới gốc cây giúp cây hạn ch sự thoát hơi nước (Lele,

2006; Nguyễn C ng Tạn, 2008) [111], [13].

Hình 1.1. Hình thái cây cọc rào

a

1

: Cây cọc rào; b2

: lá, c3

: hoa, d4

: quả, e

5

: mặt cắt hạt, f6

: hạt

Nguồn: 1. http://shop.theplantattraction.com/Jatropha-Curcas-Tree-Bio-Diesel-Fuel-Source-Physic-Nut-5-Seeds-S-Jatropha-Curcas-5.htm

2. http://www.alamy.com/stock-photo-physic-nut-jatropha-curcas-close-up-leaf-33120574.html

3. http://biofuelstp.eu/oil_crops.html

4. http://legalwealthcreation.com/2013/01/how-do-i-create-wealth-make-money-from-biodiesel-fuel-production-with-jatropha￾curcas.html

5. http://www.seedscollector.com/1000-jatropha-curcas--physic-nut-s1000.html)

6. https://en.wikipedia.org/wiki/Jatropha_curcas

8

1.1.4. Giá trị sử dụng

1.1.4.1. Trong điều trị bệnh

Trong thành phần cây cọc rào, ngư i t phân tích ược nh ng hợp chất chủ

y u như terpen, fl von, coum rin, lipid, sterol, lk loid. Nhiều bộ phận củ cây này có

th ch b nh như lá, vỏ cây, hạt và rễ. Rễ tr ti u vi m, cầm máu, tr ng ; dầu củ

hạt có tác d ng nhuận tràng; d ch nhự trắng ti t r từ v t thương củ cành có th dùng

ch b nh phong thấp, u răng, làm lành v t thương, ch tr b nh trĩ và m n

cơm; nước chi t từ lá có ch phytotoxin (curcin), chất này cũng có trong hạt cọc rào,

n u ược nghi n c u sâu hơn rất có th cung cấp cho chúng t một loại dược li u mới.

1.1.4.1. Cọc rào và nhiên liệu sinh học

Ngoài các tác d ng tr b nh k tr n, cây cọc rào ược sự chú ý ặc bi t bởi nó là

nguồn nguy n li u sản xuất nhi n li u sinh học. Hạt củ cây có ộ m (6,62%),

protein (18,2%), chất béo (38%), c rbohydr te (17,3%), sợi (15,5%) và tro (4,5%).

Dầu chi m 35 ˗ 40% hạt và 50 ˗ 60% nhân hạt. Trong dầu ch 21% các cid béo

kh ng b o hò . Hạt ược x y và ép lấy dầu hoặc dầu ược tách bằng các dung môi.

Dầu s u khi lọc ược sử d ng ng y như là nguồn nguy n li u sinh học ở dạng bổ sung,

dầu cọc rào có th trộn với dầu thư ng với tỷ l l n n 20%. Đây là nguồn năng

lượng mới, n toàn, chi phí thấp, tái sinh ược, h hẹn s là nguồn năng lượng th y

th cho thủy i n, dầu diesel, dầu lử , khí hó lỏng (LPG), th n, củi. Nguồn năng

lượng này s giúp các nước cắt giảm một khoản tiền cho năng lượng và phần nào xó

i sự mất cân bằng về sử d ng năng lượng gi các vùng. Ưu i m là khói từ dầu cọc

rào không có mùi và kh ng c y như khói dầu hỏ và kh ng lại mùi cho th c ăn s u

khi nấu (Lele, 2006; Nguyễn C ng Tạn, 2008) [111], [13].

1.1.4.3. Bảo vệ môi trường

Cọc rào là cây lâu năm, tuổi thọ củ cây là 50 năm phủ ất rất tốt, sinh trưởng

phát tri n ược ở hầu h t các loại ất xấu, nghèo dinh dưỡng, ất dốc, ất trơ sỏi á.

Vì vậy, cọc rào ược trồng tr n các vùng ất dốc s ược coi là cây “lấp ầy” l hổng

sinh thái ở các vùng sinh thái xung y u miền núi, sớm tạo r thảm thực vật bề mặt dày

ặc chống xói mòn, chống cháy, nâng c o ộ phì nhi u củ ất. Kh ng nh ng vậy, cây

còn có th trồng ở nh ng vùng ất s mạc hó , b i thải kh i thác khoáng sản, góp phần

9

ph c hồi h sinh thái các vùng này, tạo r hi u ng to lớn về bảo v m i trư ng (Lele,

2006) [111].

Cọc rào hấp th nhiều CO2 trong kh ng khí. Theo tính toán sơ bộ, một cây có

khả năng hấp th 100 g CO2/ngày trong kh ng khí, tính r m i cây có khả năng hấp

th 30 kg CO2/năm, m i h có th hấp th 48 tấn CO2/năm, góp phần giảm thi u khí

thải gây hi u ng nhà kính (Lele, 2006) [111].

1.1.4.4. Phân bón và thức ăn gia súc

S u khi ép dầu, b kh dầu có hàm lượng N 4,14 ˗ 4,78%; P2O5 0,50 ˗ 0,66%;

CaO 0,60 ˗ 0,65%; MgO 0,17 ˗ 0,21% ược sử d ng làm phân h u cơ rất tốt bón

cho các loại cây trồng, nhất là cho vùng sản xuất n ng nghi p h u cơ, n ng nghi p

sạch, vừ góp phần sản xuất sản ph m sạch, vừ nâng c o ộ phì nhi u củ ất

(Nguyễn C ng Tạn, 2008) [13].

1.1.5. Nhân giống cây cọc rào

Nh ng nghi n c u về nhân giống cây cọc rào tr n th giới và ở Vi t N m còn rất

hạn ch . Cho n n y, phương pháp nhân giống cây cọc rào chủ y u vẫn theo phương

pháp chuyền thống là giâm cành và gieo hạt. Các phương pháp nhân giống hi n ại áp

d ng tr n cây cọc rào chỉ mới phát tri n trong khoảng hơn 10 năm trở lại ây.

1.1.5.1. Phương pháp nhân giống truyền thống

N m Phi, ngư i dân trồng cây cọc rào làm rào dậu hoặc trồng cây chống

xói mòn và bảo v ất. Họ thư ng sử d ng phương pháp giâm cành vì ưu i m củ

phương pháp này là nh nh chóng tạo ược cây trưởng thành. Cành ược cắt từ các cây

cọc rào trưởng thành cắm xuống ất, n u ược chăm sóc c n thận thì s u khoảng

h i n b tháng là có ược cây ủ lớn em trồng. Cây tạo r từ phương pháp giâm

cành s u khoảng 1 năm s bắt ầu cho quả.

Trồng cây kh i thác dầu lâu năm thì phương pháp nhân giống bằng gieo hạt

ược sử d ng nhiều hơn. Bởi nh ng nghi n c u chỉ r rằng, cây tạo thành từ nhân

giống bằng giâm cành có i sống ngắn hơn, khả năng chống hạn và b nh tật kém hơn

cây ược nhân giống bằng hạt. Rễ củ cây giâm cành phát tri n y u, dễ b g y ổ

(Heller, 1996) [85]. Hạt trước khi em gieo ược lự chọn là nh ng hạt to, chắc, m y.

Hạt ược ngâm nước qu m làm tăng tỷ l nảy mầm. S u ó, hạt ược gieo vào

trong các bầu ất. Hạt s nảy mầm s u khoảng 1 tuần và cây con có th em i trồng

10

s u 45 ngày. Rễ củ cây con mọc từ hạt phát tri n, thư ng có 1 rễ cái và 4 rễ b n. Cây

trồng ngoài thực s r ho s u khoảng 3 ˗ 4 năm (Heller, 1996) [82]. Nhược i m

củ phương pháp nhân giống bằng hạt là chất lượng cây con kh ng ồng nhất bởi cây

cọc rào là cây th phấn chéo n n gi các hạt có sự khác nh u về mặt di truyền. Chẳng

hạn như xét tính trạng hàm lượng dầu trong hạt, các cây tạo r bằng gieo hạt có hàm

lượng dầu trong hạt kh ng ổn nh, gi o ộng từ 4 n 40% (Jh và cộng sự, 2007)

[89]. Do ó nhân giống bằng phương pháp gieo hạt kh ng th áp ng ủ nhu cầu cây

giống chất lượng tốt cho vi c trồng cây tr n quy m c ng nghi p.

1.1.5.2. Phương pháp nhân giống hiện đại

Các nghiên cứu trên thế giới

Các phương pháp nhân giống hi n ại có ưu i m lớn là có khả năng tạo r cây

giống với số lượng lớn trong khoảng th i gi n ngắn với chất lượng c o và ồng nhất.

Tuy nhi n, nh ng nghi n c u này còn ít hoặc chư ược c ng bố.

Suj th và Mukt (1996) [181] phát tri n kỹ thuật tái sinh cây cọc rào từ nhiều

bộ phận khác nh u củ cây như phần tr hạ di p, cuống lá và lá. Sự tạo thành chồi non

bất nh ược ch ng minh là hi u quả nhất ở m i trư ng MS bổ sung 0,5 mg/l BA và

1,0 mg/l IBA. Chồi non hình thành ược nu i và tạo rễ trong m i trư ng MS kh ng bổ

sung chất iều hò sinh trưởng cho n khi phát tri n thành cây hoàn chỉnh ư r

vư n ươm.

Sự tái sinh cây con từ các mẫu cấy tr tr n lá mầm củ cây cọc rào cũng ược

Wei và cộng sự (2004) nghi n c u thành c ng [216]. Các mẫu cấy tr tr n lá mầm in

vitro ược nu i cấy tr n m i trư ng MS có bổ sung IBA và BA. Các chồi bất nh

ược hình thành trực ti p tr n bề mặt củ mẫu cấy tr tr n lá mầm trong iều ki n k t

hợp củ 0,1 mg/l IBA và 0,5 mg/l BA với tỷ l tái sinh chồi c o nhất. Trong khi ó, sự

tái sinh chồi gián ti p th ng qu m sẹo cần phải có sự k t hợp 1,0 mg/l IBA và 0,5

mg/l BA. Chồi tái sinh có th hình thành rễ tr n m i trư ng MS kh ng có bổ sung các

chất iều hò sinh trưởng.

Suj th và cộng sự (2005) thành c ng trong nhân giống in vitro cây cọc rào

bằng phương pháp tạo c m chồi [181]. Nghi n c u tạo chồi non bằng cách nu i cấy

nách lá cây cọc rào tr n m i trư ng MS bổ sung 0,5 ˗ 1,0 mg/l TDZ, s u ó chuy n

s ng m i trư ng MS bổ sung IBA và BA. Hi u quả tạo chồi c o 10,0 ˗ 12,3 chồi/mẫu

11

cấy. Vi c tạo chồi bất nh từ lá thu ược bằng cách nu i cấy mẫu lá tr n m i trư ng

bổ sung 2,0 ˗ 10,0 mg/l BA và 1,0 mg/l IBA tạo thành m sẹo có màu trắng x nh,

các chồi bất nh s ược tạo thành s u khoảng 3 tuần, s u ó chuy n s ng m i trư ng

bổ sung 2,0 mg/l BA và 0,5 mg/l IBA.

Cây cọc rào ược tạo dòng in vitro từ các mẫy cấy ốt thân (D tt và cộng sự,

2007) [47]. Các chồi ược tái sinh từ ốt thân tr n m i trư ng có bổ sung auxin và

cytokinin riêng l hoặc k t hợp. Các chồi ược cấy chuyền s ng m i trư ng khác

nhân nh nh số lượng chồi (D tt và cộng sự, 2007) hoặc cấy s ng m i trư ng chỉ có

uxin hình thành rễ. Cây con s u khi chuy n r vư n ươm thì cho tỷ l sống sót c o

(trên 80%) [47].

Nghi n c u tái sinh chồi từ hạt cũng ược thực hi n bởi W r k god và

Sub singhe (2009) [215]. Hạt củ cây cọc rào (chư trưởng thành, trưởng thành, hoàn

toàn trưởng thành) s u khi ược thu thập và khử trùng bề mặt s ược cấy vào m i

trư ng MS, WPM và B5, có hoặc kh ng có bổ sung 1,0 g/l th n hoạt tính. Hạt giống

trưởng thành trong m i trư ng B5 cho thấy tỷ l nảy mầm sớm và tăng trưởng tốt nhất

so với các hạt chư trưởng thành và hoàn toàn trưởng thành trong m i trư ng B5, MS

và WPM. Các chồi ược nảy mầm từ hạt s ược cấy vào m i trư ng B5 có ch BA,

KIN, NAA ở các nồng ộ k t hợp khác nh u. Chồi ược nhân nh nh và phát tri n tr n

m i trư ng B5 có bổ sung 1,0 mg/l BA, 1,0 mg/l KIN và 2,0 mg/l NAA ạt số lượng

chồi c o nhất là 6,6 chồi/mẫu cấy. Bổ sung th n hoạt tính vào m i trư ng B5 kh ng có

ảnh hưởng áng k n sự nảy mầm củ hạt và sự tăng trưởng củ cây con.

Kaewpoo và Te˗ch to (2009) báo cáo về ảnh hưởng củ các loại mẫu cấy và

chất iều hò sinh trưởng l n sự hình thành chồi cây cọc rào [91]. Các loại mẫu cấy

khác nh u ( oạn thân, chồi b n, chồi ỉnh) ược nu i cấy tr n m i trư ng MS bổ sung

BA và IBA ri ng l h y k t hợp với các nồng ộ khác nh u. K t quả ch ng minh rằng

các chồi b n cấy tr n m i trư ng MS có bổ sung 0,5 mg/l BA k t hợp với 0,25 mg/l

IBA ạt số chồi c o hơn so với các thí nghi m còn lại. Chồi tái sinh ược tạo rễ (60%)

tr n m i trư ng MS bổ sung 0,5 mg/l IBA sau 30 ˗ 40 ngày nu i cấy.

Phương pháp phát sinh ph i từ t bào som (som tic embryogenesis) ˗ một c ng

c mạnh củ ngành c ng ngh sinh học tạo giống cây trồng - ược áp d ng

thành c ng lần ầu ti n tr n cây cọc rào bởi Jh và cộng sự (2007) [89]. M sẹo có khả