Luận án tiến sĩ nông nghiệp đánh giá hiệu quả của kỹ thuật chuyển gen rnai để tạo dòng lan

i

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN XUÂN DŨNG

ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA KỸ THUẬT CHUYỂN GEN RNAi

ĐỂ TẠO D NG N Dendrobium CÓ KHẢ N NG HÁNG

VI U HẢ VÀNG Cymbidium mosaic virus)

LUẬN ÁN TIẾN Ĩ NÔNG NGHIỆP

TP. HỒ CHÍ MINH- 2017

ii

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN XUÂN DŨNG

ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ CỦA KỸ THUẬT CHUYỂN GEN RNAi

ĐỂ TẠO D NG N Dendrobium CÓ KHẢ N NG HÁNG

VI U HẢ VÀNG Cymbidium mosaic virus)

Chuyên ngành: D

Mã số: 62.62.01.11

LUẬN ÁN TIẾN Ĩ NÔNG NGHIỆP

Người hướng dẫn khoa học:

1. TS. Dươ Hoa Xô

2. PGS. TS. C H H

TP. HỒ CHÍ MINH- 2017

i

LỜI C ĐO N

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Kết quả nghiên cứu hoàn

toàn trung thực, khách quan. Các số liệu được trình bày trong công trình này một

phần đã được công bố trên các Tạp chí Khoa học-công nghệ cùng các đồng tác giả,

phần còn lại chưa được công bố bởi bất kỳ ai trong bất kỳ công trình nào.

TP. Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2017

Tác giả luận án

Nguyễn Xuân Dũng

ii

LỜI CẢ ƠN

Để hoàn thành quá trình học tập và nghiên cứu của mình, tôi đã nhận được

nhiều sự giúp đỡ từ gia đình, thầy cô, đồng nghiệp, bạn bè và sự ủng hộ, tạo điều

kiện của các cơ quan và tổ chức.

Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Dương Hoa Xô - Giám

đốc Trung tâm Công nghệ Sinh học TP. Hồ Chí Minh, là người hướng dẫn chính

cho công trình nghiên cứu này. Thầy đã truyền đạt ý tưởng, định hướng nghiên cứu,

cũng như kiến thức và kinh nghiệm cho tôi trong suốt quá trình học tập, làm việc và

thực hiện luận án. Ngoài ra, với tư cách là thủ trưởng đơn vị, thầy đã chấp thuận và

tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi được tham gia chương trình đào tạo nghiên cứu

sinh.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến PGS. TS. Chu Hoàng Hà - Viện trưởng Viện

Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, là người

hướng dẫn thứ hai cho công trình nghiên cứu này. Thầy đã hướng dẫn, truyền đạt

kiến thức, tạo điều kiện hỗ trợ về mặt kỹ thuật cũng như đã đóng góp nhiều ý kiến

quý báu trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận án.

Tôi xin trân trọng gởi lời cảm ơn đến:

- Ban lãnh đạo Trung tâm Công nghệ Sinh học TP. Hồ Chí Minh đã chấp

thuận, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập.

- Ban lãnh đạo Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, Viện Khoa học Kỹ

thuật Nông nghiệp Miền Nam đã hết sức giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi

trong quá trình học tập.

- Ban lãnh đạo Sở Khoa học và Công nghệ TP. Hồ Chí Minh đã hỗ trợ một

phần kinh phí cho tôi để thực hiện công trình nghiên cứu này.

- PGS.TS. Phạm Văn Toản và tất cả cán bộ thuộc Ban Đào tạo sau đại học -

Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam và Phòng Quản lý Khoa học và Hợp tác

Quốc tế- Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam, đã tận tình giúp đỡ,

động viên tôi trong quá trình học tập.

iii

- GS. TS. Bùi Chí Bửu và tất cả quý thầy cô (đã giảng dạy và tham gia Hội

đồng đánh giá đề cương, chuyên đề nghiên cứu của nghiên cứu sinh) đã truyền đạt

kiến thức, đóng góp nhiều ý kiến quý báu và tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học

tập và nghiên cứu.

Những lời cảm ơn chân thành của tôi cũng xin được gởi đến:

- Các cán bộ, sinh viên đã và đang làm việc trong nhóm nghiên cứu chuyển

gen thực vật thuộc Phòng Công nghệ Sinh học Thực vật, Trung tâm Công nghệ

Sinh học TP. Hồ Chí Minh, đã nhiệt tình tham gia, giúp đỡ và ủng hộ tôi trong suốt

quá trình làm việc và thực hiện luận án.

- Các cán bộ nghiên cứu thuộc phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện

Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình

giúp đỡ và hỗ trợ về mặt kỹ thuật trong quá trình thực hiện luận án.

- Quý thầy cô giáo đã giảng dạy và truyền đạt kiến thức cho tôi qua các giai

đoạn học tập, các anh chị em đồng nghiệp và bạn bè thân hữu đã cùng cộng tác và

hỗ trợ tôi trong suốt quá trình học tập, làm việc và nghiên cứu.

Cuối cùng, xin gởi lời tri ân sâu sắc và những tình cảm ấm áp nhất đến Ba,

Mạ (người mẹ đã khuất) và tất cả những người thân yêu trong gia đình đã hết lòng

động viên, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình trưởng

thành, học tập và nghiên cứu.

TP. Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2017

Tác giả luận án

Nguyễn Xuân Dũng

iv

MỤC LỤC

Trang

LỜI C ĐO N...................................................................................................... i

LỜI CẢ ƠN........................................................................................................... ii

MỤC LỤC................................................................................................................ iv

DANH SÁCH BẢNG .............................................................................................. xi

DANH SÁCH HÌNH............................................................................................. xiii

MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1

1. Tính cấp thiết...............................................................................................................1

2. Mục tiêu và yêu cầu ....................................................................................................3

3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ..............................................................................3

4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn ....................................................................................3

5. Đóng góp mới của luận án ..........................................................................................4

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU..................................................................5

1.1. Sơ lược về hoa lan....................................................................................................5

1.1.1. Giới thiệu về họ hoa lan ....................................................................................5

1.1.2. Giống lan Dendrobium......................................................................................5

1.1.3. Sơ lược về PLBs (Protocorm like bodies) ........................................................6

1.2. Sơ lược về Cymbidium mosaic virus.......................................................................7

1.2.1. Phân loại, hình dạng phân tử và cấu trúc bộ gen ..............................................7

1.2.2. Sự lây nhiễm và di chuyển của virus CyMV trong cây ....................................9

1.2.3. Triệu chứng bệnh do virus CyMV gây ra .........................................................9

1.2.4. Tình hình bệnh do virus CyMV gây ra trên các giống lan ở Việt Nam..........10

1.3. Phương pháp chọn giống hoa lan...........................................................................11

1.3.1. Chọn giống bằng phương pháp cổ điển ..........................................................11

1.3.2. Chọn giống bằng phương pháp chuyển gen....................................................11

1.3.3. Phương pháp chuyển gen qua trung gian Agrobacterium tumefaciens ..........11

1.3.3.1. Sơ lược về phương pháp ..............................................................................11

1.3.3.2. Các dạng Agrobacterium tumefaciens dùng cho chuyển gen ......................13

v

1.3.3.3. Cơ chế chuyển gen qua trung gian Agrobacterium tumefaciens ................13

1.3.3.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự chuyển gen qua trung gian vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens ở hoa lan ..........................................................14

1.4. Sự can thiệp RNA (RNAi) và vai trò của nó trong chọn giống cây trồng ...........19

1.4.1. Lịch sử phát hiện RNAi ..................................................................................20

1.4.2. Cơ chế của RNAi ............................................................................................23

1.4.3. Sự khởi đầu và khuếch đại tín hiệu RNAi ......................................................25

1.4.4. Sự di chuyển của các tín hiệu RNAi ...............................................................27

1.4.5. Mối liên hệ giữa virus gây bệnh cây trồng và RNAi ......................................29

1.4.6. Vai trò của RNAi trong chọn giống cây trồng kháng virus............................30

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................36

2.1. Nội dung nghiên cứu..............................................................................................36

2.1.1. Vật liệu nghiên cứu .........................................................................................36

2.1.2. Nội dung nghiên cứu.......................................................................................39

2.2. Phương pháp nghiên cứu........................................................................................40

2.2.1. Xây dựng quy trình chuyển gen vào lan Dendrobium Sonia..........................40

2.2.1.1. Xác định các điều kiện thích hợp để tạo PLBs phục vụ cho chuyển gen ....40

2.2.1.2. Xác định nồng độ chất cảm ứng acetosyringone (AS), thời gian đồng nuôi

cấy và chủng vi khuẩn thích hợp cho việc chuyển gen vào PLBs................41

2.2.1.3. Xác định điều kiện thích hợp để loại vi khuẩn và sàng lọc PLBs chuyển gen....42

2.2.2. Phân lập và xác định trình tự gen CP của virus CyMV ..................................43

2.2.2.1. Thu thập mẫu lan nhiễm virus......................................................................43

2.2.2.2. Phân lập gen CP ...........................................................................................44

2.2.2.3. Nhân dòng gen CP .......................................................................................44

2.2.2.4. Giải trình tự gen CP và phân tích sự tương đồng của các trình tự...............46

2.2.3. Thiết kế vector chuyển gen RNAi và biến nạp vào A. tumefaciens................46

2.2.3.1. Tạo vector pENTRTM/D-TOPO®

có gắn gen CP hoặc ORF2-4+CP ..........46

2.2.3.2. Thiết kế vector chuyển gen RNAi mang đoạn gen CP và ORF2-4+CP bằng

hệ thống Gateway .........................................................................................47

vi

2.2.3.3. Tạo chủng A. tumefaciens mang vector chuyển gen RNAi

pK7GWIWG2(II)/CP hoặc pK7GWIWG2(II)/ORF2-4+CP........................48

2.2.4. Tạo cây lan chuyển gen mang cấu trúc RNAi của gen CP và ORF2-4+CP .......48

2.2.4.1. Nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn.........................................................................48

2.2.4.2. Chuyển cấu trúc RNAi của đoạn gen CP hoặc ORF2-4+CP vào PLBs qua

trung gian vi khuẩn A. tumefaciens...............................................................49

2.2.4.3. Sàng lọc PLBs mang cấu trúc gen chuyển...................................................49

2.2.4.4. Kiểm tra sự hiện diện của gen chuyển trong PLBs giả định chuyển gen ....50

2.2.4.5. Thu nhận cây lan hoàn chỉnh từ PLBs mang gen chuyển và kiểm tra sự hiện

diện của gen mục tiêu trong cây ...................................................................50

2.2.5. Đánh giá khả năng kháng virus CyMV của cây lan chuyển gen bằng lây

nhiễm virus nhân tạo trong điều kiện in vitro ..............................................51

2.2.5.1. Lây nhiễm virus CyMV vào cây lan chuyển gen trong điều kiện in vitro...51

2.2.5.2. Đánh giá khả năng kháng virus CyMV của cây lan chuyển gen .................52

2.2.6. Phân tích và xử lý số liệu ................................................................................52

2.2.7. Điều kiện nuôi cấy ..........................................................................................53

2.2.8. Thời gian và địa điểm nghiên cứu...................................................................53

CHƯƠNG 3. ẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.........................................................54

3.1. Xây dựng quy trình chuyển gen vào PLBs............................................................54

3.1.1. Các điều kiện thích hợp để tạo PLBs phục vụ cho chuyển gen ......................54

3.1.1.1. Nồng độ chất khử trùng thích hợp để tạo mẫu cấy in vitro..........................54

3.1.1.2. Môi trường thích hợp để tạo PLBs từ mô cấy in vitro.................................55

3.1.1.3. Môi trường thích hợp cho sự tăng sinh và phát triển PLBs.........................57

3.1.2. Nồng độ chất cảm ứng AS, thời gian đồng nuôi cấy và chủng vi khuẩn thích

hợp cho việc chuyển gen vào PLBs .............................................................58

3.1.2.1. Trường hợp chủng C58 ................................................................................58

3.1.2.2. Trường hợp chủng EHA105.........................................................................59

3.1.2.3. Trường hợp chủng LBA4404.......................................................................60

3.1.2.4. Về mức độ biểu hiện gen GUS ....................................................................61

vii

3.1.3. Các điều kiện thích hợp để loại vi khuẩn và sàng lọc PLBs chuyển gen........62

3.1.3.1. Nồng độ cefotaxime thích hợp để loại vi khuẩn từ PLBs............................62

3.1.3.2. Nồng độ hygromycin và kanamycin thích hợp để sàng lọc PLBs chuyển gen...63

3.2. Phân lập và xác định trình tự gen CP của virus CyMV........................................66

3.2.1. Phân lập gen CP ..............................................................................................66

3.2.2. Tạo dòng gen CP.............................................................................................67

3.2.3. Giải trình tự gen CP và phân tích sự tương đồng của các trình tự..................69

3.3. Thiết kế vector chuyển gen RNAi mang đoạn gen CP và CP + ORF2-4 ............71

3.3.1. Tạo vector pENTRTM/D-TOPO®

có gắn gen CP hoặc ORF2-4+CP.....................72

3.3.1.1. Khuếch đại gen CP từ vector nhân dòng và gen ORF2-4+CP từ vector

pBSK/ORF2-4+CP .......................................................................................72

3.3.1.2. Gắn đoạn gen CP và ORF2-4+CP vào vector pENTR ................................72

3.3.1.3. Thiết kế vector chuyển gen RNAi bằng kỹ thuật Gatewway.......................76

3.3.1.4. Tạo chủng vi khuẩn A. tumefaciens mang vector chuyển gen RNAi ..........78

3.4. Tạo cây lan chuyển gen mang cấu trúc RNAi của gen CP và ORF2-4+CP...........79

3.4.1. Chuyển cấu trúc RNAi của đoạn gen CP hoặc ORF2-4+CP vào PLBs qua

trung gian vi khuẩn A. tumefaciens..............................................................79

3.4.1.1. Giai đoạn đồng nuôi cấy ..............................................................................79

3.4.1.2. Giai đoạn khử khuẩn ....................................................................................81

3.4.2. Sàng lọc PLBs mang cấu trúc gen chuyển......................................................82

3.4.3. Kiểm tra sự hiện diện gen chuyển trong PLBs giả định chuyển gen..............83

3.4.4. Thu nhận cây lan hoàn chỉnh từ PLBs mang gen chuyển...............................85

3.5. Khả năng kháng CyMV của cây lan chuyển gen trong điều kiện in vitro ...........90

3.5.1. Về biểu hiện triệu chứng nhiễm virus CyMV.................................................90

3.5.2. Về sự hiện diện của virus trong cây lan ..........................................................92

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.....................................................................................95

1. Kết luận......................................................................................................................95

2. Đề nghị ......................................................................................................................96

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ ...................................................97

viii

TÀI LIỆU THAM KHẢO......................................................................................98

Tài liệu tiếng Việt..........................................................................................................98

Tài liệu tiếng Anh..........................................................................................................99

PHỤ LỤC

Phụ lục 1. Môi trường nuôi cấy thực vật và vi khuẩn

Phụ lục 2. Một số triệu chứng nghi nhiễm virus trên các mẫu lan thu thập

Phụ lục 3. Quy trình chuyển gen vào PLBs của lan Dendrobium Sonia qua trung gian

vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Phụ lục 4. Kết quả so sánh trình tự gen CP và gen ORF2-4 của CyMV

Phụ lục 5. Kết quả xử lý thống kê

ix

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

BA Benzyladenine

BGMV Bean golden mosaic virus

BYMV Bean yellow mosaic virus

CBP Cap binding protein

CGMMV Cucumber green mottle mosaic virus

CMV Cucumber mosaic virus

CP Coat protein gene

CPMR Coat protein-mediated resistance

CyMV Cymbidium mosaic virus

2,4-D 2,4-dichlorophenoxyacetic acid

DCL Dicer like protein

DNA Deoxyribo nucleic acid

dsRBD Double-stranded RNA binding domain

GFP Green fluorescent protein

HCPro Helper component-proteinase

hpRNA Hairpin RNA

ihpRNA Intron hairpin RNA

LB Lysogeny broth

MCS Multi cloning site

miRNA MicroRNA

mRNA Messenger RNA

MS Murashige and Skoog

LS Linsmaier and Skoog

NAA Naphthaleneacetic acid

NCR Noncoding region

NMV Narcissus mosaic virus

ORF Open reading frame

x

ORSV Odontoglossum ringspot virus

PAMV Potato aucuba mosaic virus

RdRp RNA-dependent RNA polymerase

RISC RNA-induced silencing complex

RNA Ribonucleic acid

RNAi RNA interference

siRNA Small interfering RNA

SMYEaV Strawberry mild yellow edge-associated virus

SMV Soybean mosaic virus

sRNA Small RNA

TGB Triple-gene-block

TMV Tobacco mosaic virus

TRV Tobacco rattle virus

TRSV Tobacco ringspot virus

TYLCV Tomato yellow leaf curl virus

WCMV White clover mosaic virus

xi

DANH SÁCH BẢNG

Trang

Bảng 1.1. Kết quả ứng dụng RNAi trên nhiều loại virus thực vật khác nhau................31

Bả 3.1. Tỷ lệ đoạn thân mang chồi ngủ lan Dendrobium Sonia sống vô trùng

sau 14 ngày nuôi cấy.........................................................................................54

Bả 3.2. Tỷ lệ mẫu lát cắt mỏng mô thân cây lan Dendrobium Sonia in vitro

cảm ứng với môi trường sau 4 tuần nuôi cấy..................................................55

Bả 3.3. Sự thay đổi trọng lượng PLBs trên các môi trường........................................57

Bả 3.4. Tỷ lệ mẫu dương tính sau khi nhuộm GUS ở các nồng độ AS theo

thời gian đồng nuôi cấy với chủng vi khuẩn A. tumefaciens C58. ................59

Bả 3.5. Tỷ lệ mẫu dương tính sau khi nhuộm GUS ở các nồng độ AS theo

thời gian đồng nuôi cấy với chủng vi khuẩn A. tumefaciens EHA105. ........60

Bả 3.6. Tỷ lệ mẫu dương tính sau khi nhuộm GUS ở các nồng độ AS theo

thời gian đồng nuôi cấy với chủng vi khuẩn A. tumefaciens LBA4404........61

Bả 3.7. Khả năng diệt khuẩn của cefotaxime ở các nồng độ khác nhau trên PLBs..63

Bả 3.8. Tỷ lệ PLBs chết do tác động của hygromycin ở các nồng độ khác nhau

theo thời gian nuôi cấy......................................................................................64

Bả 3.9. Tỷ lệ PLBs chết do tác động của kanamycin ở các nồng độ khác nhau,

theo thời gian nuôi cấy......................................................................................65

Bả 3.10. Tỷ lệ tương đồng giữa các trình tự gen CP của virus CyMV phân lập

ở các khu vực khác nhau tại Việt Nam............................................................70

Bả 3.11. Tỷ lệ tương đồng giữa các trình tự gen CP của virus CyMV phân lập

ở các khu vực tại Việt Nam và một số khu vực trên thế giới.........................71

Bả 3.12. Kích thước các phân đoạn thu được khi cắt vector tái tổ hợp

pK7GWIWG2(II)/CP; pK7GWIWG2(II)/ORF2-4+CP bằng XbaI

và HindIII..............................................................................................................77

xii

Bả 3.13. Tỷ lệ PLBs giả định chuyển gen thu được sau giai đoạn sàng lọc với

kanamycin. ........................................................................................................82

Bả 3.14. Kết quả kiểm tra sự hiện diện của gen mục tiêu trong PLBs chuyển gen...85

Bả 3.15. Tần suất xuất hiện của các dạng kiểu hình cây lan Dendrobium Sonia thu

được từ cụm PLBs chuyển gen. .......................................................................87

Bả 3.16. Kết quả kiểm tra sự hiện diện của gen mục tiêu trong cây lan phát triển từ

PLBs chuyển gen. .............................................................................................89

Bả 3.17. Kết quả đánh giá khả năng kháng virus của cây lan phát triển từ PLBs

chuyển gen sau 4 tuần lây nhiễm virus............................................................93

xiii

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 1.1. Hoa lan Dendrobium Sonia ................................................................................6

Hình 1.2. Hình dạng của CyMV.........................................................................................7

Hình 1.3. Cấu trúc bộ gen của virus CyMV.......................................................................8

Hình 1.4. Triệu chứng khảm vàng lá và khảm màu hoa lan Dendrobium.....................10

Hình 1.5. Sự phục hồi (kháng lại virus) ở cây thuốc lá bị nhiễm virus TRSV..............20

Hình 1.6. Hoa dã yên thảo với các gen quy định sắc tố hoa đã bị im lặng bởi RNAi...22

Hình 1.7. Cơ chế hoạt động của RNAi.............................................................................24

Hình 1.8. Hoạt động của protein RdRp trong việc khuếch đại tín hiệu RNAi [20]. .....26

Hình 1.9. Ảnh hưởng của đột biến RdRp lên sự truyền tín hiệu RNAi ở cây

A. thaliana . ......................................................................................................29

Hình 3.1. Chồi ngủ lan Dendrobium Sonia tăng trưởng trên môi trường MS

sau 4 (A) và 8 (B) tuần nuôi cấy. .....................................................................54

Hình 3.2. Sự hình thành PLBs từ lát cắt mỏng thân Dendrobium Sonia trên môi trường

MS bổ sung BA và NAA ở các nồng độ khác nhau sau 6 tuần nuôi cấy......56

Hình 3.3. Sự tăng sinh PLBs của lan Dendrobium Sonia trên môi trường MS bổ sung

BA và NAA ở các nồng độ khác nhau, sau 10 tuần nuôi cấy........................57

Hình 3.4. Các mức độ biểu hiện gen GUS của PLBs chuyển gen .................................61

Hình 3.5. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm khuếch đại gen CP ..................................66

Hình 3.6. Kết quả điện di kiểm tra gen CP trong các dòng vi khuẩn với cặp mồi

F-CCP và R-CCP định vị trên gen...................................................................67

Hình 3.7. Kết quả điện di kiểm tra gen CP trong các dòng vi khuẩn với cặp mồi

pJET1.2 định vị trên vector..............................................................................68

Hình 3.8. Kết quả điện di sự kiểm tra gen CP trong các dòng vi khuẩn bằng phản ứng

cắt với enzyme BamHI và EcoRI.....................................................................68