Kỹ thuật PCR:

Sau đây là những nét chung nhất của kỹ thuật PCR:

Nguyên tắc cơ bản của PCR:

+ Khái quát chung:

PCR là phương pháp dùng enzym khuyếch đại chọn lọc một đoạn ADN

theo luật số mũ. Phản ứng nhân gene được thực hiện với enzym ADN chịu

nhiệt, hai mồi tổng hợp và 4 loại deoxyribonucleic (dATP, dGTP, dCTP và

dTTP). Mỗi một chu kỳ phản ứng nhân gene gồm 3 bước (xem hình vẽ minh

hoạ): Bước 1 là biến tính ADN, có tác dụng tách hai sợi đơn từ sợi khuôn xoắn

kép. Bước 2 là bắt cặp hai mồi vào hai sợi đơn của khuôn. Bước 3 là kéo dài

chuỗi theo mồi, chiều 5’-3’ với quá trình trùng hợp gắn các dNTP dọc theo sợi

khuôn để tạo thành phiên bản mới theo nguyên tắc bổ sung. Tính đặc hiệu của

phản ứng được quy định bởi mồi và sự sao chép trực tiếp theo trình tự sợi

khuôn giữa hai mồi. Như vậy, kết quả tạo ra hàng triệu phiên bản sợi khuôn

trong vài giờ.

Mồi cho phản ứng là các đoạn ADN có kích thước 20-30 nucleotid được

thiết kế theo trình tự của đoạn gene cần khuyếch đại dựa theo dữ liệu có sẵn.

Mỗi cặp mồi phải hoàn thành chức năng của mình trong toàn bộ phản ứng, tức

là chúng phải bám đặc hiệu vào đúng vị trí riêng cho từng mồi. Sở dĩ như vậy

là do nếu chúng không bám vào vị trí đặc hiệu thì không thể khuyếch đại được

đoạn gene đích. Với các gene có độ bảo thủ cao như rADN thì khi cặp mồi được

thiết kế thì chúng có thể nhân được gene từ nhiều đối tượng. Ngược lại, trong

nhiều trường hợp dùng mồi không đặc hiệu thì có thể nhân được các sản phẩm

PCR không đặc hiệu. Tuy nhiên, cả hai kết quả trên đều được dùng cho định

typ vi sinh vật.

Thí nghiệm phản ứng PCR lần đầu tiên dùng mảnh Klenow của enzym

ADN polymerase I từ E.coli. Tuy nhiên, enzym này bị biến tính tại 94oC và như

vậy cần phải bổ sung enzym mới sau mỗi chu kỳ phản ứng. Đến nay quá trình

này đã được cải thiện do dùng enzym Taq ADN polymerase (Taq = Thermus aquaticus

) chịu nhiệt. Enzym này được tách ra từ vi khuẩn sống ở suối nước nóng. Tốc

độ xúc tác cho phản ứng của enzym này rất nhanh, có thể đạt khoảng 8000

bp/phút tại 755oC. Hoạt tính enzym giảm một nửa khi xử lý tại 92.5oC trong

230 phút hoặc 40 phút tại 95oC. Như vậy khi dùng enzym này thì không cần bổ

sung enzym mới sau mỗi chu kỳ phản ứng.

+ Các thông số kỹ thuật:

Bất kỳ một phản ứng PCR nào cũng bắt đầu bằng việc tách ADN làm sợi

khuôn. Nói chung, theo lý thuyết chỉ cần một sợi khuôn cũng đủ cho phản ứng

tạo ra sản phẩm nhưng trong thực tế cần khoảng 10-100 ng/phản ứng. Đôi khi

chuẩn bị ADN theo phương pháp đơn giản không cần tinh sạch cũng phù hợp

cho phản ứng PCR. Tuy nhiên, điều quan trọng là tránh sự có mặt của EDTA

(acide éthylène-diamine-tétraacétique) hoặc đệm phosphat vì kết quả sẽ làm

giảm Mg++ (do EDTA hoặc tạo thành muối Mg3(PO4)2 khi nhiệt độ cao). Phản

ứng PCR có thể nhân được đoạn gene dài 10 Kb nhưng trong thực tế thường

dùng để nhân các đoạn có kích thước ngắn hơn (<2 Kb). Có thể tham khảo các

thông số thành phần phản ứng PCR trong bảng dưới đây.

Bảng 1.8. Thành phần phản ứng PCR.

Thành phần Số lượng

ADN khuôn 10-100 ng

dNTP (mỗi loại) 200 mM

Mồi xuôi 0.1 – 1.0 mM

Mồi ngược 0.1 – 1.0 mM

Taq polymerase 1 U

KCL 50 mM

Tris HCL (pH 8.4) tại 25oC 10 mM

MgCl2 2.85 mM

Gelatin 100 mg/l

Nonidet-40 0.05%

Số chu kỳ cho phản ứng tạo sản phẩm đặc hiệu từ 20-30 chu kỳ. Điều

chú ý là các mồi cho phản ứng phải có nhiệt độ bắt cặp với ADN đích gần nhau,

có trình tự không bổ sung nhau để tránh bắt cặp với nhau. Trình tự đầu 3’ của

các mồi cũng phải khác với trình tự vùng trung tâm của sản phẩm để tránh tạo

thành hiện tượng kẹp tóc. Nói chung, ngày nay người ta có thể tối ưu hoá việc

chọn mồi nhờ sự trợ giúp của các chương trình máy tính.

Đôi khi cũng xuất hiện hiện tượng nhân sản phẩm PCR không đặc hiệu,

điều này thường hay xuất hiện khi dùng các cặp mồi suy biến từ chuỗi acid

amin. Tuy nhiên trong hầu hết các trường hợp này thì việc thay đổi điều kiện

phản ứng có thể hạn chế được các sản phẩm không mong muốn. Các thành

phần như nhiệt độ, nồng độ Mg++ và enzym có ảnh hưởng lớn đến tính đặc

hiệu. Sự có mặt của nonidet-40 có tác dụng tăng hiệu suất của phản ứng.

Việc ứng dụng kỹ thuật RFLP với sản phẩm PCR có thể là cách nhanh

chóng để tìm sự khác biệt đối với các gene khác nhau. Với cách này yêu cầu

sản phẩm PCR phải sạch và đồng nhất. Theo cách này trình tự có thể được

thực hiện như sau: Sau khi điện di kiểm tra độ sạch của sản phẩm PCR, tiến

hành kết tủa với ethanol. Kết tủa được hoà với đệm thích hợp và sau đó được

xử lý với enzym cắt hạn chế thích hợp. Kiểm tra kết quả thông thường trên gel

agarose, trong một số trường hợp có thể trên gel polyacylamid để thu được độ