khảo sát tình hình nhiễm chlamydophila psittaci trên gà tại khánh hòa

i

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh

học và Môi trường, trường Đại học Nha Trang đã luôn quan tâm, chỉ bảo và giảng

dạy nhiệt tình, giúp cho tôi có được những kiến thức quý báu trong suốt thời gian

học tập tại trường.

Tôi xin dành lời cảm ơn sâu sắc nhất đến Tiến sĩ Lê Lập, trưởng Bộ môn

Nghiên cứu Vi trùng, Tiến sĩ Võ Thành Thìn, phó trưởng Bộ môn Nghiên cứu Vi

trùng, anh Lê Trung Hiếu, chị Đặng Thị Sao Mai, anh Lê Đình Hải và các anh chị

thuộc Bộ môn Nghiên cứu Vi trùng, Phân viện thú y miền Trung đã định hướng, dìu

dắt và tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian tôi thực tập tại phân viện.

Tôi xin chân thành cảm ơn Thạc sĩ Văn Hồng Cầm, Bộ môn Công nghệ sinh

học, Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, đã luôn luôn nhiệt tình hướng dẫn và

giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đồ án tốt nghiệp này.

Cuối cùng, tôi bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến gia đình, bạn bè, những

người luôn quan tâm giúp đỡ, động viên, đồng thời là chỗ dựa tinh thần rất lớn

giúp tôi hoàn thành tốt mọi công việc được giao trong suốt thời gian học tập và

thực hiện đồ án vừa qua.

Nha Trang, tháng 06 năm 2012

Sinh viên

Đoàn Văn Tiến

ii

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ..............................................................................................................i

MỤC LỤC……...........................................................................................................ii

DANH MỤC BẢNG...................................................................................................v

DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ .......................................................................vi

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT.................................................................................vii

LỜI MỞ ĐẦU .............................................................................................................1

CHƯƠNG I:TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................3

1.1. Khái niệm và lịch sử bệnh Chlamydophilosis....................................................3

1.2. Tổng quan về vi khuẩn Chlamydophila psittaci.................................................4

1.2.1. Phân loại vi khuẩn Cp. psittaci .................................................................4

1.2.2. Hình thái vi khuẩn Cp. psittaci .................................................................4

1.2.3. Các tính chất sinh hóa vi khuẩn Cp. psittaci.............................................6

1.2.4. Cấu trúc kháng nguyên vi khuẩn Cp. psittaci...........................................6

1.2.5. Độc lực của vi khuẩn Cp. psittaci .............................................................8

1.2.6. Con đường lây nhiễm Cp. psittaci ............................................................9

1.3. Triệu chứng bệnh Chlamydophilosis................................................................10

1.4. Bệnh tích bệnh Chlamydophilosis....................................................................11

1.5. Chẩn đoán bệnh Chlamydophilosis..................................................................12

1.5.1. Thu thập và xử lý mẫu ............................................................................12

1.5.2. Quan sát trực tiếp bằng phương pháp nhuộm .........................................13

1.5.3. Phân lập vi khuẩn Cp. psittaci ................................................................13

1.5.3.1. Phương pháp nuôi cấy tế bào............................................................13

1.5.3.2. Phương pháp gây nhiễm vi khuẩn trên phôi gà ................................14

1.5.4. Phát hiện các kháng nguyên đặc hiệu cho vi khuẩn Cp. psittaci ............14

1.5.5. Phát hiện các gen đặc hiệu cho vi khuẩn Cp. psittaci.............................14

1.5.6. Xét nghiệm huyết thanh học ...................................................................16

1.5.7. Chẩn đoán phân biệt................................................................................17

iii

1.6. Điều trị bệnh Chlamydophilosis.......................................................................17

1.7. Phòng bệnh Chlamydophilosis.........................................................................19

1.8. Bệnh Chlamydophilosis ở người ......................................................................19

CHƯƠNG II: NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU ..........................................................................................................................21

2.1. Đối tượng nghiên cứu.......................................................................................21

2.2. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................21

2.3. Nguyên liệu nghiên cứu....................................................................................21

2.3.1. Mẫu bệnh phẩm.......................................................................................21

2.3.2. Môi trường, hóa chất dùng trong nghiên cứu .........................................21

2.3.3. Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu ...............................................................22

2.4. Phương pháp nghiên cứu..................................................................................23

2.4.1. Phương pháp lấy mẫu ngoáy hầu họng ở gà ...........................................23

2.4.2. Phương pháp tách chiết DNA Cp. psittaci từ mẫu ngoáy hầu họng.......23

2.4.2.1. KIT chiết tách DNA..........................................................................23

2.4.2.2. Quy trình chiết tách DNA .................................................................23

2.4.3. Chuẩn hóa nested PCR phát hiện Cp. psittaci trong mẫu bệnh phẩm ....24

2.4.3.1. Phương pháp xác định nhiệt độ gắn tối ưu của mồi..........................25

2.4.3.2. Phương pháp xác định tính đặc hiệu của mồi ...................................25

2.4.4. Phương pháp nested PCR phát hiện gen omp1 .......................................27

2.4.5. Phát hiện DNA: Phương pháp điện di trên gel agarose ..........................29

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..........................................................31

3.1. Chuẩn hóa phản ứng nested PCR .....................................................................31

3.1.1. Xác định nhiệt độ gắn tối ưu của mồi .....................................................31

3.1.2. Xác định tính đặc hiệu của mồi...............................................................35

3.2. Kết quả khảo sát tình hình nhiễm Cp. psittaci trên gà tại Khánh Hòa.............37

3.2.1. Tỷ lệ mẫu ngoáy hầu họng gà nhiễm Cp. psittaci theo độ tuổi của gà ...........41

3.2.2. Tỷ lệ mẫu ngoáy hầu họng gà nhiễm Cp. psittaci theo loại gà...............43

iv

3.2.3. Tỷ lệ mẫu ngoáy hầu họng gà nhiễm Cp. psittaci theo phương thức

chăn nuôi ...........................................................................................................44

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ..........................................................46

4.1. Kết luận ............................................................................................................46

4.2. Kiến nghị ..........................................................................................................46

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

v

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Các serovar của Chlamydophila psittaci....................................................8

Bảng 2.1. Thành phần bộ kít tách chiết QIAamp DNA Mini Kit ............................22

Bảng 2.2. Trình tự mồi dùng cho phản ứng nested PCR..........................................28

Bảng 2.3. Thành phần của một phản ứng nested PCR .............................................28

Bảng 3.1. Nhiệt độ nóng chảy của các cặp mồi........................................................31

Bảng 3.2. Kết quả xác định nhiệt độ gắn thích hợp của cặp mồi xuôi và cặp

mồi ngược ................................................................................................34

Bảng 3.3. Tổng hợp kết quả PCR các mẫu thu được tại hai địa điểm Ninh Hòa

và Cam Lâm (Khánh Hòa).......................................................................40

Bảng 3.4. Tỷ lệ mẫu ngoáy hầu họng gà nhiễm Cp. psittaci theo độ tuổi của gà ....42

Bảng 3.5. Tỷ lệ mẫu ngoáy hầu họng gà nhiễm Cp. psittaci theo loại gà................43

Bảng 3.6. Tỷ lệ mẫu ngoáy hầu họng gà nhiễm Cp. psittaci theo phương thức

chăn nuôi..................................................................................................44

vi

DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Hình 1.1. Ảnh chụp hiển vi điện tử về sự lan truyền của vi khuẩn

Chlamydophila psittaci dạng thể vùi (INCLUS) trong các tế bào

L929 được gây nhiễm. ...............................................................................5

Hình 2.1. Sơ đồ minh họa vị trí gắn hai cặp mồi Cp1-F, Cp1-R, Cp2-F và

Cp2-R trên gen omp1 của vi khuẩn Chlamydophila psittaci...................28

Hình 3.1. Kết quả điện di gradient PCR gen omp1 của vi khuẩn

Chlamydophila spp. sử dụng cặp mồi Cp1-F và Cp1-R với nhiệt độ

bắt cặp dao động trong khoảng Ta = 48-580C.........................................32

Hình 3.2. Kết quả điện di gradient PCR gen omp1 của vi khuẩn

Chlamydophila spp. sử dụng cặp mồi Cp2-F và Cp2-R với nhiệt độ

bắt cặp dao động trong khoảng Ta = 50-620C.........................................33

Hình 3.3. Kết quả chạy PCR xác định tính đặc hiệu của cặp mồi ngoài Cp1-F

và Cp1-R..................................................................................................35

Hình 3.4. Kết quả chạy PCR xác định tính đặc hiệu của cặp mồi trong Cp2-F

và Cp2-R..................................................................................................37

Hình 3.5. Kết quả chạy PCR1 của 29 mẫu ngoáy hầu họng (1-29) thu tại thị

xã Ninh Hòa, tỉnh Khánh Hòa .................................................................38

Hình 3.6. Kết quả chạy PCR1 của 35 mẫu ngoáy hầu họng (30-64) thu tại

huyện Cam Lâm, tỉnh Khánh Hòa ...........................................................39

Hình 3.7. Kết quả chạy PCR2 các mẫu dương tính với PCR1 (3, 4, 7, 9, 11,

13, 18 và 26) ............................................................................................40

Hình 3.8. Kết quả PCR2 các mẫu dương tính với PCR1 (30, 37, 38, 41, 45,61,

63 và 64) ..................................................................................................41