Khảo sát tính chất methyl hóa vượt mức của một số gene định vị trên nhiễm sắc thể số 3 ở ung thư vòm họng trên người bệnh Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ

KHẢO SÁT TÍNH CHẤT METHYL HÓA VƯỢT MỨC CỦA MỘT

SỐ GENE ĐỊNH VỊ TRÊN NHIỄM SẮC THỂ SỐ 3 Ở UNG THƯ

VÒM HỌNG TRÊN NGƯỜI BỆNH VIỆT NAM

Mã số đề tài: E2019-07-3

Chủ nhiệm đề tài: TS. Lao Đức Thuận

TpHCM, tháng 3 năm 2022

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ

KHẢO SÁT TÍNH CHẤT METHYL HÓA VƯỢT MỨC CỦA MỘT

SỐ GENE ĐỊNH VỊ TRÊN NHIỄM SẮC THỂ SỐ 3 Ở UNG THƯ

VÒM HỌNG TRÊN NGƯỜI BỆNH VIỆT NAM

Mã số đề tài: E2019-07-3

Xác nhận của tổ chức chủ trì

(ký, họ tên, đóng dấu)

Chủ nhiệm đề tài

(ký, họ tên)

TpHCM, tháng 3 năm 2022

i

MỤC LỤC

Danh mục bảng .....................................................................................................................vi

Danh mục sơ đồ.................................................................................................................. viii

Danh mục chữ viết tắt ...........................................................................................................ix

Thông tin kết quả nghiên cứu (tiếng việt)..............................................................................x

Thông tin kết quả nghiên cứu (tiếng anh)...........................................................................xiv

Danh sách thành viên đề tài ...............................................................................................xvii

MỞ ĐẦU.......................................................................................................................... xviii

1. TỔNG QUAN .................................................................................................................1

1.1. Tổng quan về ung thư...............................................................................................1

1.2. Tổng quan về ung thư vòm họng..............................................................................1

1.2.1. Giải phẫu vòm họng...........................................................................................1

1.2.2. Các giai đoạn bệnh của UTVH..........................................................................2

1.2.3. Tình hình UTVH trên thế giới và Việt Nam......................................................2

1.3. Nguyên nhân gây bệnh và phân loại UTVH ............................................................3

1.4. Epigenetics và UTVH...............................................................................................4

1.5. Sự methyl hóa bất thường trên các gene ức chế khối u............................................7

1.5.1. ADAMTS9 (ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif 9)...7

1.5.2. DLEC1 (Deleted in lung and esophageal cancer 1) .........................................7

1.5.3. RASSF1A (Ras association domain family member 1) ....................................9

1.5.4. ZMYND10 (Zinc finger, MYND-type containing 10).....................................10

1.6. Tổng quan về tình hình nghiên cứu........................................................................13

ii

1.7. Tổng quan về phương pháp nghiên cứu .................................................................13

2. VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP ..........................................................................................15

2.1. Vật liệu......................................................................................................................15

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu..........................................................................................15

2.1.2. Các phần mềm và các trang web được sử dụng .................................................15

2.2. Phương pháp nghiên cứu ...........................................................................................16

2.2.1. Khai thác cơ sở dữ liệu .......................................................................................16

2.2.1.2. Khảo sát in silico ..............................................................................................18

2.2.2. Quy trình thực nghiệm............................................................................................18

2.2.2.1. Tách chiết DNA theo quy trình:......................................................................18

2.2.2.2. Quy trình biến đổi Bisulfite .............................................................................20

2.2.2.3. Khảo sát tính chất methyl hóa các gene trên NST số 3....................................22

2.2.3. Thống kê và phân tích kết quả ............................................................................24

3. KẾT QUẢ......................................................................................................................25

3.1. Kết quả meta-analysis.............................................................................................25

3.1.1. Kết quả phân tích tổng hợp gene DLEC1........................................................31

3.1.2. Kết quả phân tích tổng hợp gene RASSF1A ....................................................37

3.1.3. Kết quả phân tích tổng hợp gene ZMYND10...................................................43

3.2. Kết quả in silico......................................................................................................48

3.2.1. Khảo sát tính chất vật lí của mồi bằng chương trình IDT ...............................48

3.2.2. Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi thông qua chương trình Annhyb .....................53

3.3. Kết quả thực nghiệm...............................................................................................56

iii

3.3.1. Đặc điểm bộ mẫu .............................................................................................56

3.3.2. Phân tích sự methyl hóa các gene ADAMTS9, DLEC1, RASSF1A và ZMYND10

58

4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ...........................................................................................70

4.1. Kết luận...................................................................................................................70

4.2. Đề nghị ...................................................................................................................70

Tài liệu tham khảo .............................................................................................................71

Sản phẩm công bố khoa học ................................................................................................79

Sản phẩm đào tạo .................................................................................................................79

iv

Danh mục hình

Hình 1.1. Vị trí ung thư vòm họng

Hình 1.2. Biểu đồ tỷ lệ mắc các loại ung thư phổ biến (Globocan).

Hình 1.3. Cơ chế sự methyl hóa. A. Sự methyl hóa cytosine nhờ DNMT; B. Cấu trúc của

SAM và SAH

Hình 1.4. Sự methyl hóa đảo CpG liên quan đến sự biểu hiện của gene (Le và cs., 2018).

Hình 1.5. Tần số methyl hóa vượt mức, giảm methyl hóa ở các loại ung thư khác nhau

Hình 1.6. Sơ đồ hoạt hóa con đường tín hiệu STAT3 bởi DLEC1 (Li và cs., 2018).

Hình 1.7. A. Các locus gene RASSF1; B. Các đồng dạng của gene RASSF1

Hình 1.8. Mô hình cho cơ chế methyl hóa vùng promoter gene ZMYND10 bởi sự tương tác

của nhân tố E2F

Hình 1.9. Nguyên tắc của phương pháp MSP.

Hình 1.10. Cơ chế biến đổi bisulfite.

Hình 3.1. Biểu đồ tần số methyl hóa của DLEC1 trên mẫu UTVH.

Hình 3.2. Biểu đồ tần số methyl hóa của DLEC1 trên mẫu lành.

Hình 3.3. Biểu đồ tần số methyl hóa DLEC1 và UTVH dựa trên mô hình bất biến.

Hình 3.4. Biểu đồ hình phễu của tần số methyl hóa DLEC1 và nguy cơ mắc UTVH.

Hình 3.5. Biểu đồ tần số methyl hóa DLEC1 và UTVH dựa trên mô hình bất biến sau khi loại

bỏ các nghiên cứu.

Hình 3.6. Biểu đồ hình phễu của tần số methyl hóa DLEC1 và nguy cơ mắc UTVH sau khi

loại bỏ các nghiên cứu.

Hình 3.7. Biểu đồ tần số methyl hóa của RASSF1A trên mẫu UTVH.

Hình 3.8. Biểu đồ tần số methyl hóa của RASSF1A trên mẫu lành.

v

Hình 3.9. Biểu đồ mối tương quan sự methyl hóa của RASSF1A giữa mẫu bệnh và mẫu lành

thông qua chỉ số OR.

Hình 3.10. Biểu đồ hình phễu của tần số methyl hóa RASSF1A và nguy cơ mắc UTVH.

Hình 3.11. Biểu đồ tần số methyl hóa của ZMYND10 trên mẫu UTVH.

Hình 3.12. Biểu đồ tần số methyl hóa của ZMYND10 trên mẫu lành.

Hình 3.13. Biểu đồ tần số methyl hóa ZMYND10 và UTVH dựa trên mô hình bất biến.

Hình 3.14. Biểu đồ hình phễu của tần số methyl hóa ZMYND10 và nguy cơ mắc UTVH.

Hình 3.15. Kết quả khảo sát mồi.

Hình 3.16. Kết quả MSP của gene ADAMTS9.

Hình 3.17. Kết quả MSP của gene DLEC1.

Hình 3.18. Kết quả MSP của gene RASSF1A

Hình 3.19. Kết quả MSP của gene BLU.

Hình 3.20. Phân tích kết quả giải trình tự.

vi

Danh mục bảng

Bảng 1.1. Các gene ức chế khối u bị methyl hóa vượt mức định vị tại vùng nhiễm sắc thể 3p

Bảng 2.1 Tần số methyl hóa của gene ADAMTS9, DLEC1, RASSF1A và ZMYND10

Bảng 2.2. Thành phần phản ứng của Nested-MSP.

Bảng 2.3. Nhiệt độ bắt cặp và thời gian kéo dài của các gene chu trình MSP.

Bảng 3.1. Tần số methyl hóa của các gene ADAMTS9, DLEC1, RASSF1A, ZMYND10.

Bảng 3.2. Phân tích tổng hợp trên các nhóm của sự methyl hóa DLEC1 và nguy cơ mắc

UTVH.

Bảng 3.3. Phân tích độ nhạy của sự methyl hóa DLEC1 và nguy cơ mắc UTVH bằng mô hình

bất biến

Bảng 3.4. Phân tích tổng hợp trên các nhóm của sự methyl hóa RASSF1A và nguy cơ mắc

UTVH.

Bảng 3.5. Phân tích độ nhạy của sự methyl hóa RASSF1A và nguy cơ mắc UTVH bằng mô

hình bất biến

Bảng 3.6. Phân tích tổng hợp trên các nhóm của sự methyl hóa ZMYND10 và nguy cơ mắc

UTVH.

Bảng 3.7. Phân tích độ nhạy của sự methyl hóa ZMYND10 và nguy cơ mắc UTVH bằng mô

hình bất biến

Bảng 3.8. Thông số vật lí các cặp mồi

Bảng 3.9. Kết quả vị trí bắt cặp và kích thước sản phẩm của các cặp mồi.

Bảng 3.10. Đặc điểm bộ mẫu nghiên cứu

Bảng 3.11. Kết quả phân tích thống kê sự methyl hóa của ADAMTS9, DLEC1, RASSF1A và

ZMYND10

vii

Bảng 3.12. Kết quả phân tích thống kê sự methyl hóa 1 trong 4 gene ADAMTS9, DLEC1,

RASSF1A và ZMYND10

Bảng 3.13. Kết quả phân tích mối tương quan giữa sự methyl hóa của các gene ADAMTS9,

DLEC1, RASSF1A và ZMYND10 và đặc điểm lâm sàng.

Bảng 3.14. Kết quả phân tích mối tương quan giữa sự methyl hóa của 1 trong 4 gene

ADAMTS9, DLEC1, RASSF1A và ZMYND10 và lâm sàng.

viii

Danh mục sơ đồ

Sơ đồ 2.1. Chu trình nhiệt của phản ứng Nested-MSP

Sơ đồ 3.1. Quy trình thực hiện nghiên cứu.