Khảo sát tính chất đột biến điểm trên Gen LDLR và ApoB của bệnh cao Cholesterol trong máu có tính chất gia đình (Familial Hypercholesterolemia, FH) bằng phương pháp PCR kết hợp giải trình tự

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP. HCM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài:

KHẢO SÁT TÍNH CHẤT ĐỘT BIẾN ĐIỂM TRÊN

GEN LDLR VÀ ApoB CỦA BỆNH CAO

CHOLESTEROL TRONG MÁU CÓ TÍNH CHẤT

GIA ĐÌNH (FAMILIAL

HYPERCHOLESTEROLEMIA, FH) BẰNG

PHƯƠNG PHÁP PCR KẾT HỢP GIẢI TRÌNH TỰ

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ

CBHD: PGS. TS. Lê Huyền Ái Thúy

SVTH: Nguyễn Thanh Duy

MSSV: 1153010123

Khóa: 2011

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP. HCM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài:

KHẢO SÁT TÍNH CHẤT ĐỘT BIẾN ĐIỂM TRÊN

GEN LDLR VÀ ApoB CỦA BỆNH CAO

CHOLESTEROL TRONG MÁU CÓ TÍNH CHẤT

GIA ĐÌNH (FAMILIAL

HYPERCHOLESTEROLEMIA, FH) BẰNG

PHƯƠNG PHÁP PCR KẾT HỢP GIẢI TRÌNH TỰ

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ

CBHD: PGS. TS. Lê Huyền Ái Thúy

SVTH: Nguyễn Thanh Duy

MSSV: 1153010123

Khóa: 2011

GVHD ký xác nhận:

………………………..

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2015

Khóa Luận Tốt Nghiệp 2015

SVTH: Nguyễn Thanh Duy Trang ii

LỜI CẢM ƠN

Em xin chân thành cảm ơn Quý Thầy Cô Khoa Công nghệ Sinh Học trường Đại học

Mở TP.HCM đã tận tình dạy bảo em trong những năm vừa qua. Đồng thời, Quý

Thầy Cô cũng chính là những người đã truyền đạt những kiến thức quý báu để làm

hành trang cho em bước vào đời.

Đặc biệt nhân dịp này, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành nhất của mình tới

PGS. TS. Lê Huyền Ái Thuý và ThS. Trương Kim Phượng là những người đã tận

tình chỉ ra hướng nghiên cứu, hướng dẫn, quan tâm, động viên và giúp đỡ từng

bước đi của em trong quá trình thực hiện chuyên đề Khoá Luận Tốt Nghiệp.

Em cũng xin chân thành cảm ơn ThS. Lao Đức Thuận đã tạo điều kiện cho em được

thực hiện chuyên đề Khóa Luận Tốt Nghiệp tại phòng thí nghiệm Sinh Học Phân

Tử, trường Đại học Mở TP.HCM.

Đồng thời em cũng xin gửi lời cảm ơn đến tập thể cán bộ Khoa Xét Nghiệm cũng

như một số khoa khác tại Bệnh Viện Đa Khoa Xuyên Á. Các bác, các anh và các

chị là những người đã hết lòng hỗ trợ em trong quá trình thu thập mẫu bệnh phẩm

tại bệnh viện.

Cũng trong dịp này, em xin gửi lời cảm ơn của mình đến các bạn và các em trong

phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử đã hết lòng giúp đỡ em thực hiện chuyên đề

Khoá Luận Tốt Nghiệp này.

Cuối cùng, em xin gửi lời biết ơn sâu sắc nhất của mình đến gia đình và người thân

đặc biệt là bố mẹ em. Mọi người đã dõi theo, ủng hộ, quan tâm và động viên em rất

nhiều trong quá trình thực hiện chuyên đề Khoá Luận Tốt Nghiệp.

Sinh viên

Nguyễn Thanh Duy

Khóa Luận Tốt Nghiệp 2015

SVTH: Nguyễn Thanh Duy Trang iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

A Adenine

ApoA Apolipoprotein A

ApoB – 100 Apolipoprotein B 100

ApoB – 48 Apolipoprotein B 48

ApoB Apolipoprotein B

ApoC Apolipoprotein C

ApoE Apolipoprotein E

ARMS Amplification-Refractory Mutation System

AS - PCR Allele - Specific PCR

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

bp base pair

C Cytosine

CHD Coronary Heart Disease

DGGE Denaturing Gradient Gel Electrophoresis

DNA Deoxyribonucleic Acid

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

EGFP Enhanced Green Fluorescent Protein

EtBr Ethidium Bromide

FDB Familial Defective Apolipoprotein B

FH Familial Hypercholesterolemia

G Guanidine

HDL - C High Density Lipoprotein Cholesterol

HDL High Density Lipoprotein

Hex Analysis Heteroduplex Analysis

Hex SSCP Heteroduplex Single - Strand Conformation Polymorphism

IDL Intermediate – Density Lipoproteins

IDOL Inducible Degrader of the LDLR

IDT Integrated DNA Technologies

Khóa Luận Tốt Nghiệp 2015

SVTH: Nguyễn Thanh Duy Trang iv

kbp kilo base pair

kDa kilodalton

LDL – C Low Density Lipoprotein Cholesterol

LDL Low Density Lipoprotein

LDLR Low Density Lipoprotein Receptor

LDLRAP1 LDLR Adaptor Protein 1

LXR Liver X Receptor

MLPA Multiplex Ligation – Dependent Probe Amplification

NCBI National Center Biotechnology Information

NIH National Institutes of Health

NST Nhiễm Sắc Thể

OD Optical Density

PCR Polymerase Chain Reaction

PCSK9 Proprotein Convertase Subtilin/Kexin 9

PSM PCR-mediated Site - directed Mutagenesis

RE Restriction Enzymes

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphisms

SDS Sodium Dodecyl Sulfate

SRE Steroid Response Element.

SREBP Steroid Response Element Binding Protein.

SSCP Single Strand Conformation Polymorphism

T Thymine

TAE Tris - acetate - EDTA

TE Tris - EDTA

TGGE Temperature Gradient Gel Electrophoresis

Tm Melting Temperature

VLDL Very Low Density Lipoprotein

WHO World Health Organization

Khóa Luận Tốt Nghiệp 2015

SVTH: Nguyễn Thanh Duy Trang v

DANH MỤC BẢNG

Bảng II.1. Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi LDLR ..................................... 20

Bảng II.2. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR với cặp mồi LDLR............................. 21

Bảng II.3. Thành phần phản ứng PCR với bộ mồi ApoB........................................ 21

Bảng II.4. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR với bộ mồi ApoB ............................... 21

Bảng III.1. Số lượng các bài báo khoa học thu thập được....................................... 25

Bảng III.2. Số dạng đột biến/loại đột biến của gen LDLR....................................... 26

Bảng III.3. Số lượng các đột biến điểm thuộc gen LDLR trên các Châu Lục ......... 27

Bảng III.4. Số lượng các đột biến trên từng exon thuộc gen LDLR ........................ 29

Bảng III.5. Các phương pháp phát hiện đột biến điểm trên gen LDLR ................... 31

Bảng III.6. Số lượng công trình nghiên cứu trên từng dạng đột biến gen ApoB ..... 32

Bảng III.7. Số lượng các dạng đột biến thuộc gen ApoB trên các Châu Lục........... 33

Bảng III.8. Số lượng các đột biến trên từng exon của gen ApoB............................. 34

Bảng III.9. Các phương pháp phát hiện đột biến trên gen ApoB............................. 36

Bảng III.10. Thông tin về cặp mồi LDLR................................................................ 37

Bảng III.11. Thông tin về các thông số vật lý của cặp mồi LDLR_F và

LDLR_R ............................................................................................. 42

Bảng III.12. Thông tin về hệ mồi ApoB................................................................... 44

Bảng III.13. Thông tin về các thông số vật lý của mồi ApoB_F, ApoB_R1 và

ApoB_R2 ............................................................................................ 52

Bảng III.14. Chỉ số đo OD của các mẫu huyết tương sau tách chiết ....................... 53

Bảng III.15. Kết quả các đột biến được phát hiện trên exon 4 của gen LDLR ở

một số mẫu bệnh phẩm ....................................................................... 55

Bảng III.16. Kết quả phân tích đột biến R3500Q trên gen ApoB ở một số mẫu

bệnh phẩm........................................................................................... 59

Bảng III.17. Chỉ số sinh hóa của một số mẫu bệnh phẩm xuất hiện đột biến trên

gen LDLR và ApoB ............................................................................. 59

Khóa Luận Tốt Nghiệp 2015

SVTH: Nguyễn Thanh Duy Trang vi

DANH MỤC HÌNH

Hình I.1. Cấu trúc hoá học của cholesterol [75] ........................................................ 2

Hình I.2. Cấu trúc của lipoprotein [30]...................................................................... 3

Hình I.3. Một số apolipoprotein trên bề mặt lipoprotein [72] ................................... 4

Hình I.4. Vị trí gen LDLR trên nhiễm sắc thể số 19 [74]........................................... 6

Hình I.5. Các vùng chức năng của thụ thể LDLR [5]................................................ 8

Hình I.6. Vị trí gen ApoB trên nhiễm sắc thể số 2 [73] ........................................... 10

Hình I.7. Tỷ lệ phân bố số lượng đột biến theo từng exon trên gen LDLR [76]...... 11

Hình III.1. Số dạng đột biến/loại đột biến của gen LDLR ....................................... 27

Hình III.2. Số lượng các đột biến điểm thuộc gen LDLR trên các Châu Lục.......... 28

Hình III.3. Số lượng các đột biến trên từng exon thuộc gen LDLR......................... 30

Hình III.4. Các phương pháp phát hiện đột biến điểm trên gen LDLR.................... 31

Hình III.5. Số lượng công trình nghiên cứu trên từng đột biến gen ApoB............... 33

Hình III.6. Số lượng các dạng đột biến trên gen ApoB ở từng Châu Lục................ 34

Hình III.7. Số lượng các đột biến trên từng exon của gen ApoB............................. 35

Hình III.8. Các phương pháp phát hiện đột biến điểm trên gen ApoB..................... 36

Hình III.9. Kết quả khảo sát mồi LDLR_F bằng công cụ BLAST trên NCBI........ 38

Hình III.10. Kết quả khảo sát mồi LDLR_R bằng công cụ BLAST trên NCBI...... 39

Hình III.11. Kết quả khảo sát mồi LDLR_F bằng chương trình Annhyb................ 40

Hình III.12. Kết quả khảo sát mồi LDLR_R bằng chương trình Annhyb ............... 41

Hình III.13. Vị trí bắt cặp của LDLR_F và LDLR_R trên gen NG_009060.1........ 41

Hình III.14. Kích thước sản phẩm của cặp mồi LDLR_F và LDLR_R .................. 42

Hình III.15. Kết quả khảo sát mồi ApoB_F bằng công cụ BLAST trên NCBI....... 45

Hình III.16. Kết quả khảo sát mồi ApoB_R1 bằng công cụ BLAST trên NCBI .... 46

Hình III.17. Kết quả khảo sát mồi ApoB_R2 bằng công cụ BLAST trên NCBI .... 47

Hình III.18. Kết quả khảo sát mồi ApoB_F bằng chương trình Annhyb ................ 48

Hình III.19. Kết quả khảo sát mồi ApoB_R1 bằng chương trình Annhyb.............. 49

Hình III.20. Vị trí bắt cặp của ApoB_F và ApoB_R1 trên gen FJ525873.1 ........... 49

Hình III.21 .Kích thước sản phẩm của cặp mồi ApoB_F và ApoB_R1 .................. 50

Hình III.22. Kết quả khảo sát mồi ApoB_R2 bằng chương trình Annhyb.............. 50

Hình III.23. Vị trí bắt cặp của ApoB_F và ApoB_R2 trên gen FJ525873.1 ........... 51

Hình III.24. Kích thước sản phẩm của cặp mồi ApoB_F và ApoB_R2 .................. 51

Hình III.25. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gen LDLR .................................. 54

Hình III.26. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi khuếch đại allele hoang

dại ở một số mẫu bệnh phẩm ............................................................... 57

Hình III.27. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi khuếch đại allele đột

biến ở một số mẫu bệnh phẩm ............................................................. 58

Khóa Luận Tốt Nghiệp 2015

SVTH: Nguyễn Thanh Duy Trang vii

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN.......................................................................................................... II

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT.............................................................................III

DANH MỤC BẢNG.................................................................................................V

DANH MỤC HÌNH ...............................................................................................VI

MỤC LỤC ............................................................................................................ VII

ĐẶT VẤN ĐỀ.........................................................................................................IX

I. TỔNG QUAN..................................................................................................... 1

I.1. TỔNG QUAN VỀ CHOLESTEROL............................................................. 2

I.1.1. Định nghĩa ............................................................................................... 2

I.1.2. Vai trò của cholesterol trong cơ thể ........................................................ 2

I.1.3. Điều hoà cholesterol trong cơ thể ........................................................... 2

I.1.4. Phân tử vận chuyển cholesterol trong máu (Lipoprotein)....................... 3

I.2. TỔNG QUAN VỀ BỆNH CAO CHOLESTEROL TRONG MÁU CÓ

TÍNH GIA ĐÌNH (FAMILIAL HYPERCHOLESTEROLEMIA, FH)......... 5

I.2.1. Bệnh cao cholesterol trong máu có tính gia đình.................................... 5

I.2.2. Nguyên nhân ............................................................................................ 6

I.3. TỔNG QUAN VỀ GEN LDLR VÀ PROTEIN LDLR................................... 6

I.3.1. Vị trí của gen ........................................................................................... 6

I.3.2. Chức năng của protein LDLR.................................................................. 7

I.3.3. Rối loạn chức năng của protein LDLR.................................................... 8

I.4. TỔNG QUAN VỀ GEN APOB VÀ PROTEIN APOB .................................... 9

I.4.1. Vị trí của gen ........................................................................................... 9

I.4.2. Chức năng của protein ApoB................................................................. 10

I.4.3. Rối loạn chức năng của protein ApoB................................................... 10

I.5. CÁC DẠNG ĐỘT BIẾN TRÊN GEN LDLR VÀ APOB .............................. 11

I.5.1. Đột biến trên gen LDLR ........................................................................ 11

I.5.2. Đột biến trên gen ApoB ......................................................................... 12

I.6. MỘT SỐ KỸ THUẬT PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN TRÊN GEN LDLR

VÀ APOB....................................................................................................... 12

I.6.1. Phương pháp giải trình tự (Sequencing) ............................................... 12

I.6.2. Phương pháp phân biệt tính đa hình trong cấu hình sợi đơn DNA

(Single Strand Conformation Polymorphism, SSCP)............................. 12

I.6.3. Phương pháp điện di trên gel biến tính (Denaturing Gradient Gel

Eletrophoresis, DGGE).......................................................................... 13

I.6.4. Phương pháp Multiplex Ligation – Dependent Probe Amplifications

(MPLA)................................................................................................... 13

I.6.5. Phương pháp phân biệt tính đa hình dựa vào chiều dài giới hạn của

các đoạn DNA tương đồng (Restriction Fragment Length

Polymorphisms, RFLP) .......................................................................... 13

I.6.6. Phương pháp Southern Blot .................................................................. 13

Khóa Luận Tốt Nghiệp 2015

SVTH: Nguyễn Thanh Duy Trang viii

I.6.7. Phương pháp Allele – Specific PCR (AS – PCR) .................................. 14

I.7. MỘT SỐ CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU NỔI BẬT VỀ ĐẶC ĐIỂM

PHÂN TỬ CỦA BỆNH CAO CHOLESTEROL TRONG MÁU CÓ

TÍNH GIA ĐÌNH ......................................................................................... 14

II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................... 16

II.1. VẬT LIỆU .................................................................................................. 17

II.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................................................... 17

II.2.1. Khai thác dữ liệu .................................................................................. 17

II.2.2. Khảo sát in silico .................................................................................. 17

II.2.3. Khảo sát thực nghiệm........................................................................... 17

III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN............................................ 24

III.1. KHAI THÁC DỮ LIỆU............................................................................. 25

III.1.1. Gen LDLR............................................................................................ 26

III.1.2. Gen ApoB............................................................................................. 32

III.2. KHẢO SÁT IN SILICO ............................................................................. 37

III.2.1. Gen LDLR............................................................................................ 37

III.2.2. Gen ApoB............................................................................................. 43

III.3. KHẢO SÁT THỰC NGHIỆM................................................................... 53

III.3.1. Tách chiết DNA bộ gen người ............................................................. 53

III.3.2. Phản ứng PCR giải trình tự exon 4 của gen LDLR............................. 53

III.3.3. Phân tích đột biến điểm trên gen LDLR.............................................. 54

III.3.4. Phản ứng AS – PCR kết hợp giải trình tự phát hiện đột biến R3500Q

trên gen ApoB...................................................................................... 57

III.3.5. Phân tích kết quả đột biến R3500Q trên gen ApoB............................. 58

IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................... 61

IV.1. KẾT LUẬN ............................................................................................... 62

IV.2. ĐỀ NGHỊ................................................................................................... 63

V. TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................. 64

VI. PHỤ LỤC ....................................................................................................... 75

PHỤ LỤC 1 – THÔNG TIN MỘT SỐ MẪU BỆNH PHẨM ............................... 76

PHỤ LỤC 2 – MỘT SỐ DẠNG ĐỘT BIẾN TRÊN GEN LDLR ......................... 77

PHỤ LỤC 3 – MỘT SỐ DẠNG ĐỘT BIẾN TRÊN GEN APOB.......................... 85

PHỤ LỤC 4 – KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ EXON 4 TRÊN GEN LDLR Ở

MỘT SỐ MẪU BỆNH PHẨM ..................................................... 86

PHỤ LỤC 5 – KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ ALLELE ĐỘT BIẾN R3500Q

TRÊN GEN APOB TRÊN MỘT SỐ MẪU BỆNH PHẨM............ 90

Khóa Luận Tốt Nghiệp 2015

SVTH: Nguyễn Thanh Duy Trang ix

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh cao cholesterol trong máu có tính gia đình (Familial Hypercholesterolemia,

FH) là dạng bệnh lý có tính chất di truyền trội trên nhiễm sắc thể thường (Palacios

và cộng sự, 2012). Bệnh FH với tính chất tăng bất thường hàm lượng cholesterol

trong máu, dẫn đến tăng nguy cơ mắc các bệnh lý khác: bệnh tim mạch vành

(Coronary Heart Disease, CHD), nhồi máu cơ tim, đột quỵ, gan nhiễm mỡ (Alves

và cộng sự, 2010; Sun và cộng sự, 2005).

Theo báo cáo của tổ chức Y Tế Thế Giới (WHO, 2008) về tình hình cao cholesterol,

tỷ lệ người trưởng thành có chỉ số hàm lượng cholesterol cao trên thế giới là 39%.

Tại Đông Nam Á, tỉ lệ cao cholesterol ở nam và nữ là 29% (WHO, 2008).

Nguyên nhân dẫn đến bệnh FH là do thay đổi tính chất di truyền (đột biến điểm) ở

các gen có chức năng trong quá trình điều hòa lượng cholesterol trong máu (LDLR,

ApoB, PCSK9, LDLRAP1), chế độ dinh dưỡng (chế độ ăn chứa nhiều lipid)…

(Soufi và cộng sự, 2004; Martra và cộng sự, 2012). Nguyên nhân chủ yếu là do đột

biến điểm ở các gen điển hình: LDLR và ApoB (Marduel và cộng sự, 2010).

Hiện nay, trên thế giới có nhiều công trình điển hình theo hướng nghiên cứu xác

định các đột biến điểm trên gen LDLR và ApoB dựa vào các kỹ thuật PCR giải trình

tự, AS - PCR (Brown và cộng sự, 1986; Innerarity và cộng sự, 1987; Abifadel và

cộng sự, 2003)…. Tuy nhiên, tại Việt Nam có rất ít công trình nghiên cứu về tính

chất đột biến của các gen LDLR và ApoB.

Nhằm mục đích tìm hiểu thông tin và xác định rõ nét tính chất đột biến điểm trên

các gen LDLR và ApoB ở các bệnh nhân mắc bệnh cao cholesterol trong máu có

tính gia đình ở Việt Nam, cụ thể là ở khu vực Thành phố Hồ Chí Minh. Chúng tôi

thực hiện chuyên đề Khoá Luận Tốt Nghiệp “Khảo sát tính chất đột biến điểm

trên gen LDLR và ApoB của bệnh cao cholesterol trong máu có tính chất gia

đình (Familial Hypercholesterolemia, FH) bằng phương pháp PCR kết hợp

giải trình tự”.