Khảo sát sự hiện diện của miRNA-141 và PTEN trên bệnh nhân ung thư vòm họng tại Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN

KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA

miRNA-141 VÀ PTEN TRÊN BỆNH NHÂN

UNG THƯ VÒM HỌNG TẠI VIỆT NAM

MÃ SỐ ĐỀ TÀI: 19

TP.HCM, tháng 4 năm 2018

ii

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN

KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA

miRNA-141 VÀ PTEN TRÊN BỆNH NHÂN

UNG THƯ VÒM HỌNG TẠI VIỆT NAM

Mã số đề tài: 19

Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Hoàng Danh

Khoa: Công Nghệ Sinh Học

Các thành viên:

Nguyễn Hoàng Danh

K’ Trọng Nghĩa

Nguyễn Hoàng Nhật Minh

Hoàng Văn Nam

Quang Trọng Minh

Giảng viên hướng dẫn: ThS. Lao Đức Thuận

TP.HCM, tháng 4 năm 2018

iii

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

1. Thông tin chung:

- Tên đề tài: KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN miRNA-141 VÀ PTEN TRÊN BỆNH

NHÂN UNG THƯ VÒM HỌNG TẠI VIỆT NAM

- Sinh viên thực hiện:

Sinh viên thực hiện 1: NGUYỄN HOÀNG DANH

Lớp: DH15YD01 Khoa: CNSH Năm thứ: 3 Số năm đào tạo: 4

Sinh viên thực hiện 2: K’ TRỌNG NGHĨA

Lớp: DH15YD01 Khoa: CNSH Năm thứ: 3 Số năm đào tạo: 4

Sinh viên thực hiện 3: NGUYỄN HOÀNG NHẬT MINH

Lớp: DH14VS01 Khoa: CNSH Năm thứ: 4 Số năm đào tạo: 4

Sinh viên thực hiện 4: HOÀNG VĂN NAM

Lớp: DH14VS01 Khoa: CNSH Năm thứ: 4 Số năm đào tạo: 4

Sinh viên thực hiện 5: QUANG TRỌNG MINH

Lớp: DH16SH01 Khoa: CNSH Năm thứ: 2 Số năm đào tạo: 4

Giảng viên hướng dẫn: ThS. Lao Đức Thuận

2. Mục tiêu đề tài:

Mục tiêu tổng quát: Khảo sát tính chất biểu hiện của miRNA-141 và PTEN trên

bệnh nhân ung thư vòm họng/ người lành Việt Nam. Từ đó, hướng tới việc sử dụng

miRNA-141 và PTEN như là dấu chứng sinh học tiềm năng ứng dụng trong chẩn đoán/

tiên lượng sớm ung thư vòm họng trên cộng đồng người Việt Nam.

Mục tiêu cụ thể:

- Khảo sát sự biểu hiện miRNA-141 và gene PTEN trên bệnh nhân ung thư vòm

họng người Việt Nam/ người lành (được chẩn đoán không mắc bệnh ung thư vòm họng).

iv

- Xác định mối tương quan giữa sự biểu hiện của miRNA-141và gene PTEN với

sự hình thành ung thư vòm họng.

3. Tính mới và sáng tạo:

Hiện tại ở Việt Nam vẫn chưa có một công trình thực nghiệm nào nghiên cứu về

miRNA. Đây là công trình đầu tiên tìm hiểu về tính chất biểu hiện của miRNA (cụ thể

ở đây là miR-141) và gene đích của miRNA-141. Cùng với đó, nghiên cứu này cũng là

công trình đầu tiên nghiên cứu mối hệ giữa tính chất biểu hiện miRNA-141 và PTEN

trên bệnh nhân ung thư vòm họng tại Việt Nam.

Vị trí sinh bệnh của ung thư vòm họng gây khó khăn cho việc chẩn đoán, tiên

lượng và thu nhận mẫu ung thư. Chính vì lý do đó, điểm nhấn của đề tài là chẩn đoán

sớm ung thư vòm họng thông qua việc phát hiện sự biểu hiện của các phân tử miRNA￾141 và PTEN bằng phương pháp khuếch đại trình tự mục tiêu (PCR – Polymerase Chain

Reaction). Đây là phương pháp dễ thực hiện, dựa trên việc chuẩn đoán phân tử RNA

hay DNA. Phương pháp này không qua các khâu phẫu thuật phức tạp, không gây tổn

hại đến bệnh nhân. Phương pháp này dễ thực hiện và ít tốn kém. Nguồn mẫu chủ yếu là

dịch phết và mẫu mô sinh thiết vòm họng. Tất cả đều thực hiện trên chính bệnh nhân ở

khu vực miền Nam Việt Nam với các đặc thù mang tính vùng miền.

4. Kết quả nghiên cứu:

4.1. Kết quả meta-analysis

Dựa trên kết quả phân tích cho thấy miRNA-141 biểu hiện cao ở mẫu bệnh

(96/155 mẫu miR-141 biểu hiện cao, chiếm 61,94%) so với ở mẫu lành (30/93 mẫu miR￾141 biểu hiện cao; chiếm 32,26%) làm tăng nguy cơ mắc bệnh ung thư vòm họng với

chỉ số OR = 3,51 (95%CI = 2,028 – 6,062; mô hình phân tích ngẫu nhiên) và giá trị RR

= 1,93 (95%CI = 1,404 – 2,658 mô hình phân tích ngẫu nhiên). Thêm vào đó, chúng tôi

ghi nhận tính chất mất biểu hiện của PTEN ở mẫu bệnh (236/413 mẫu mất biểu hiện

PTEN, chiếm 57,14%) so với ở mẫu lành (19/161 mẫu mất biểu hiện PTEN, chiếm

11,80%) làm tăng nguy cơ mắc bệnh ung thư vòm họng với chỉ số OR = 11,20 (95%CI

= 4,360 - 28,805; mô hình phân tích ngẫu nhiên) và giá trị RR = 3,93 (95%CI = 1,910 –

8,088; mô hình phân tích ngẫu nhiên). Mối tương quan này tăng khi áp dụng mô hình

phân tích ảnh hưởng ngẫu nhiên với bộ dữ liệu được chọn lọc, kết quả cho thấy sự mất

v

biểu hiện của PTEN ở mẫu bệnh (172/301 mẫu mất biểu hiện PTEN, chiếm 57,14%) so

với ở mẫu lành (7/118 mẫu mất biểu hiện PTEN, chiếm 5,93%) làm tăng nguy cơ mắc

bệnh ung thư vòm họng với chỉ số OR = 20,83 (95%CI = 9,149 – 47,427; mô hình phân

tích ngẫu nhiên) và giá trị RR = 7,037 (95%CI = 2,989 – 16,549; mô hình phân tích ngẫu

nhiên). Xét sự tương quan giữa tính chất mất biểu hiện gene PTEN với các phân hạng

phản ánh đặc điểm lâm sàng của bệnh ung thư vòm họng, kết quả phân tích tổng hợp

của chúng tôi khẳng định tính chất mất biểu hiện gene PTEN là một đặc trưng của bệnh

nhân ung thư vòm họng có giai đoạn bệnh muộn bên cạnh việc có sự xuất hiện hạch

bạch huyết.

4.2. Kết quả thực nghiệm

Thu nhận mẫu: các mẫu sử dụng trong nghiên cứu được thu nhận từ các bệnh

nhân đến khám tại phòng khám Tai – Mũi – Họng, Bệnh viện Chợ Rẫy Thành phố Hồ

Chí Minh. Bộ mẫu gồm 49 mẫu mô được chẩn đoán chính xác bằng giải phẫu bệnh là

ung thư vòm họng thông qua các phương pháp nhuộm Hematoxylin và Eosin (HE).

Đồng thời, 40 mẫu ở dạng dịch phết được thu nhận và kiểm tra âm tính với kết quả

nhuộm HE.

Tiến hành thực nghiệm trên tổng số 20 mẫu bệnh và 20 mẫu lành, tần số biểu

hiện của miRNA-141 là 60% ở mẫu bệnh và ở mẫu lành là 10% (p = 0,03). Cùng với

đó, nhóm nghiên cứu cũng ghi nhận tần số biểu hiện của PTEN trên 29 mẫu ung thư và

23 mẫu lành là 48,28% và 82,61% (p = 0,0236).

Phân tích bằng giá trị 2

-ΔΔCt cho thấy, mức biểu hiện của miRNA-141 tăng gấp

10,38 lần khi so sánh với mẫu lành (2-ΔΔCt = 9,38), mức biểu hiện PTEN giảm 10,4 lần

khi so sánh với các mẫu lành(2-ΔΔCt = 0,09)

5. Đóng góp về mặt kinh tế - xã hội, giáo dục và đào tạo, an ninh quốc phòng và

khả năng áp dụng của đề tài:

Nghiên cứu góp phần trong công tác phát triển các nghiên cứu về tính chất biểu

hiện của miRNA vượt mức trên một số các miRNA tiềm năng trên ung thư vòm họng

nhằm hòa nhịp chung với các hướng phát triển tiên tiến trong lĩnh vực phòng chống và

tiên lượng ung thư. Đồng thời, nghiên cứu này hướng tới việc sử dụng chúng như các

vi

dấu chứng sinh học tiềm năng (potential biomarker) ứng dụng trong việc chẩn đoán sớm

ung thư vòm họng.

6. Công bố khoa học của sinh viên từ kết quả nghiên cứu của đề tài (ghi rõ tên tạp

chí nếu có) hoặc nhận xét, đánh giá của cơ sở đã áp dụng các kết quả nghiên cứu

(nếu có)

7. Các hội nghị khoa học tham gia:

Tham gia hội nghị: The 10th International Kasetsart University Science and

Technology Annual Research Symposium tổ chức ngày 30 – 31/5/2018. Một bài báo

cáo Oral được chấp nhận: “Initial study of PTEN expression in Vietnamese in

nasopharyngeal carcinoma patients”, nhóm tác giả Nguyễn Hoàng Danh, K’ Trọng

Nghĩa, Ngô Đông Kha, Lao Đức Thuận, Lê Huyền Ái Thúy

Ngày … tháng … năm …

Sinh viên chịu trách nhiệm chính

Thực hiện đề tài

(ký và ghi rõ họ tên)

………………………….

vii

Nhận xét của người hướng dẫn về những đóng góp khoa học của sinh viên thực

hiện đề tài:

...........................................................................................................................................

...........................................................................................................................................

...........................................................................................................................................

...........................................................................................................................................

...........................................................................................................................................

...........................................................................................................................................

...........................................................................................................................................

...........................................................................................................................................

...........................................................................................................................................

...........................................................................................................................................

...........................................................................................................................................

...........................................................................................................................................

...........................................................................................................................................

...........................................................................................................................................

...........................................................................................................................................

...........................................................................................................................................

Ngày … tháng … năm …

Xác nhận của đơn vị Người hướng dẫn

(ký tên và đóng dấu) (ký và ghi rõ họ tên)

………………………… …………………………………

viii

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

THÔNG TIN VỀ SINH VIÊN

CHỊU TRÁCH NHIỆM CHÍNH THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

I. SƠ LƯỢC VỀ SINH VIÊN

Họ và tên: NGUYỄN HOÀNG DANH

Ngày sinh: 18/04/1997

Nơi sinh: Tân Hiệp – Kiên Giang

Lớp: DH15YD01 Khóa: 2015-2019

Khoa: Công Nghệ Sinh Học

Địa chỉ liên hệ: 4 Nguyễn Văn Lên, phường Phú Lợi, Tp.Thủ Dầu Một, tỉnh Bình Dương

Điện thoại: 01658804542 Email: [email protected]

II. QUÁ TRÌNH HỌC TẬP

 Năm thứ 1

Ngành học: Công Nghệ Sinh Học Khoa: Công Nghệ Sinh Học

Kết quả xếp loại học tập: Khá

 Năm thứ 2

Ngành học: Công Nghệ Sinh Học Khoa: Công Nghệ Sinh Học

Kết quả xếp loại học tập: Khá

 Năm thứ 3

Ngành học: Công Nghệ Sinh Học Khoa: Công Nghệ Sinh Học

Ngày … tháng … năm …

Xác nhận của đơn vị Sinh viên chịu trách nhiệm

(ký tên và đóng dấu) chính thực hiện đề tài

(ký và ghi rõ họ tên)

Ảnh 4x6

ix

MỤC LỤC

DANH MỤC HÌNH ẢNH..............................................................................................xi

DANH MỤC BẢNG BIỂU..........................................................................................xiv

DANH MỤC VIẾT TẮT...............................................................................................xv

ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................................................1

PHẦN I – TỔNG QUAN ................................................................................................2

1. TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ....................................................................................1

1.1. Khái niệm về ung thư................................................................................................1

1.2.Tình hình ung thư trên thế giới và Việt Nam............................................................1

2. TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ VÒM HỌNG.............................................................2

2.1. Sơ lược về ung thư vòm họng...................................................................................2

2.2.Tình hình ung thư vòm họng trên thế giới và Việt Nam ..........................................2

2.3.Bệnh nguyên .............................................................................................................3

3. microRNA (miRNA) và gene đích PTEN...................................................................4

3.1. Sơ nét về miRNA......................................................................................................4

3.2.Cơ chế phân tử hoạt động của miRNA tác động đến mRNA...................................5

3.3.Cấu trúc của miRNA-141 (has-mir-141)..................................................................7

3.4. Sự biểu hiện của miRNA-141 trong nhiều loại ung thư khác nhau..........................8

3.5.Các tính chất của miRNA - một dấu chứng sinh học trong tiên lượng và chẩn đoán

sớm ung thư ...................................................................................................................10

3.6.Cấu trúc protein PTEN............................................................................................11

3.7.Con đường truyền tín hiệu PTEN/AKT phụ thuộc vào miRNA-141 trong tiến triển

ung thư vòm họng..........................................................................................................11

4. CHỨNG NỘI (INTERNAL CONTROL).................................................................14

4.1.Chứng nội (internal control) ...................................................................................14

4.2. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)........................................15

4.3. U6 small nuclear RNA 2 (U6 snRNA) ...................................................................16

5. PHƯƠNG PHÁP PCR VÀ RT-PCR ........................................................................17

5.1. Polymerase Chain Reaction (PCR).........................................................................17

5.2.Reverse Transcription – Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)...........................17

5.3.Realtime Polymerase Chain Reaction.....................................................................19

PHẦN II – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ................................................................1

x

1. VẬT LIỆU.................................................................................................................18

1.1.Các phần mềm và trang web được sử dụng ............................................................18

1.2.Mẫu thí nghiệm.......................................................................................................19

1.3. Dụng cụ - thiết bị - hóa chất....................................................................................19

1.4. Quá trình nghiên cứu thực nghiệm ........................................................................21

2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.............................................................................22

2.1. Khai thác cơ sở dữ liệu ...........................................................................................22

2.2. Quy trình thực nghiệm............................................................................................23

2.3. Phân tích thống kê...................................................................................................27

PHẦN III – KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ KẾT LUẬN............................................29

1. KẾT QUẢ KHẢO SÁT CƠ SỞ DỮ LIỆU ..............................................................27

1.1. Kết quả phân tích tổng hợp (Meta – analysis)........................................................27

1.2. Khảo sát ảnh hưởng của miRNA-141 bằng phần mềm / công cụ tin sinh học.......48

1.3. Kết quả khảo sát vị trí bắt cặp của miRNA-141 trên trình tự đích mPTEN...........51

1.4. Kết quả khảo sát mồi...............................................................................................54

2. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM ....................................................................................63

2.1. Kết quả tối ưu hóa quy trình khuếch đại mRNA-PTEN và GAPDH .....................63

2.2. Kết quả khuếch đại trình tự bằng Realtime PCR....................................................66

3. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THỐNG KÊ......................................................................68

4. KẾT LUẬN...............................................................................................................73

4.1. Kết quả khảo sát in silico........................................................................................73

4.2. Kết quả thực nghiệm...............................................................................................74

4.3.Các công trình nghiên cứu được công bố ...............................................................74

4.4.Các hội nghị khoa học tham gia..............................................................................74

PHẦN IV – THẢO LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ....................................................................75

1. THẢO LUẬN............................................................................................................76

2. ĐỀ NGHỊ...................................................................................................................76

TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................................77

xi

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1. Bản đồ tỉ lệ ung thư trên thế giới.....................................................................1

Hình 1.2. Vị trí giải phẫu của ung thư vòm họng............................................................2

Hình 1.3. Bản đồ về tỉ lệ ung thư vòm họng trên thế giới...............................................3

Hình 1.4. Sơ đồ biểu diễn cấu trúc kẹp tóc của pri-miRNA ...........................................5

Hình 1.5. Sự bắt cặp giữa miRNA và mạch mRNA đích................................................6

Hình 1.6. Vị trí trình tự miRNA-141 trên nhiễm sắc thể số 12 ở người .........................7

Hình 1.7. Sơ đồ biểu diễn cấu trúc kẹp tóc của pre-miR-141. ........................................7

Hình 1.8. Trình tự của năm phân tử của họ phân tử miRNA-200...................................7

Hình 1.9. Cấu trúc của protein PTEN............................................................................11

Hình 1.10. Sơ đồ miRNA-141 gắn lên gene đích PTEN...............................................11

Hình 1.11. Con đường truyền tín hiệu PTEN/AKT phụ thuộc vào miRNA-141..........13

Hình 1.12. Nguyên tắc của phương pháp PCR..............................................................17

Hình 1.13. RT-PCR với giai đoạn RT dùng mồi đặc hiệu ............................................18

Hình 1.14. RT-PCR với giai đoạn RT dùng mồi ngẫu nhiên........................................18

Hình 1.15. Cơ chế phát huỳnh quang của Sybr Green. .................................................19

Hình 2.1. Sơ đồ tóm tắt quy trình nghiên cứu ...............................................................21

Hình 2.2. Chu trình nhiệt phản ứng RT-PCR................................................................27

Hình 3.1. Sơ đồ mô tả quy trình chọn lọc công trình nghiên cứu vào bộ dữ liệu phân

tích tổng hợp..................................................................................................................27

Hình 3.2. Kết quả phân tích tính chất biểu hiện cao của miRNA-141 trên bộ dữ liệu 3

nghiên cứu ca – chứng về bệnh ung thư vòm họng, dựa trên chỉ số nguy cơ mắc bệnh.

.......................................................................................................................................30

Hình 3.3. Kết quả phân tích tính chất biểu hiện cao của miRNA-141 trên bộ dữ liệu 3

nghiên cứu ca – chứng về bệnh ung thư vòm họng dựa trên chỉ số tỷ suất chênh........31

Hình 3.4. Đồ thị “Funnel plot” đánh giá tính thiên vị trên bộ dữ liệu 3 công trình

nghiên cứu về bệnh ung thư vòm họng, dựa trên chỉ số nguy cơ mắc bệnh. ................32

Hình 3.5. Sơ đồ mô tả quy trình chọn lọc công trình nghiên cứu vào bộ dữ liệu phân

tích tổng hợp của PTEN.................................................................................................33

Hình 3.6. Kết quả phân tích tính chất mất biểu hiện của gene PTEN trên bộ dữ liệu 7

nghiên cứu ca – chứng về bệnh ung thư vòm họng, dựa trên chỉ số nguy cơ mắc bệnh

.......................................................................................................................................36

Hình 3.7. Kết quả phân tích tính chất mất biểu hiện của gene PTEN trên bộ dữ liệu 7

nghiên cứu ca – chứng về bệnh ung thư vòm họng, dựa trên chỉ số tỷ suất chênh.......37

Hình 3.8. Đồ thị “Funnel plot” đánh giá tính thiên vị trên bộ dữ liệu 7 công trình

nghiên cứu về bệnh ung thư vòm họng, dựa trên chỉ số nguy cơ mắc bệnh. ................38

Hình 3.9. Kết quả phân tích tính chất mất biểu hiện của gene PTEN trên bộ dữ liệu 5

nghiên cứu ca – chứng về bệnh ung thư vòm họng, dựa trên chỉ số nguy cơ mắc bệnh.

.......................................................................................................................................40