Khảo sát sự hiện diện của các MRNA BART (RPMS1, A73 và BARF0) mã hóa cho Epstein-Barr Virus liên quan đến ung thư vòm họng trên cộng đồng người Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN

KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA CÁC

mRNA BART (RPMS1, A73 VÀ BARF0) MÃ HÓA CHO

EPSTEIN-BARR VIRUS

LIÊN QUAN ĐẾN UNG THƯ VÒM HỌNG TRÊN

CỘNG ĐỒNG NGƯỜI VIỆT NAM

TP. HCM, tháng 4 năm 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN

KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA CÁC

mRNA BART (RPMS1, A73 VÀ BARF0) MÃ HÓA CHO

EPSTEIN-BARR VIRUS

LIÊN QUAN ĐẾN UNG THƯ VÒM HỌNG TRÊN

CỘNG ĐỒNG NGƯỜI VIỆT NAM

Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Hoàng Nhật Minh

Khoa: Công Nghệ Sinh Học

Thành viên: Nguyễn Thị Thùy Trang

Ngô Văn Tài

Hà Thị Phương Trinh

GVHD: ThS. Lao Đức Thuận

TP. HCM, tháng 4 năm 2018

Nghiên cứu khoa học i

SVTH: Nguyễn Hoàng Nhật Minh

MỤC LỤC

DANH MỤC HÌNH ẢNH ........................................................................................... iv

DANH MỤC BẢNG BIỂU ......................................................................................... vi

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT.................................................................................. vii

ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................................................1

1. UNG THƯ VÀ UNG THƯ VÒM HỌNG.............................................................2

1.1. Ung thư..............................................................................................................2

1.2. Ung thư vòm họng............................................................................................2

1.2.1. Giải phẫu vòm mũi họng.............................................................................2

1.2.2. Sơ lược về ung thư vòm họng......................................................................3

1.2.3. Tình hình ung thư vòm họng trên thế giới và Việt Nam..............................4

1.2.4. Nguyên nhân gây ung thư vòm họng...........................................................6

2. EPSTEIN-BARR VIRUS .......................................................................................7

2.1. Tổng quan về Epstein-Barr Virus (EBV) ......................................................7

2.2. BamHI-A rightward transcripts (BARTs) ....................................................8

2.3. mRNA RPMS1 .................................................................................................9

2.4. mRNA A73......................................................................................................10

2.5. mRNA BARF0................................................................................................11

3. KĨ THUẬT PCR, RT-PCR và REALTIME-PCR.............................................12

3.1. Kỹ thuật PCR .................................................................................................12

3.2. Kỹ thuật Reverse Transcription PCR (RT-PCR).......................................13

3.3. Kỹ thuật Realtime-PCR ................................................................................14

3.3.1. Định nghĩa.................................................................................................14

3.3.2. Biểu đồ khuếch đại của Realtime-PCR.....................................................15

1. VẬT LIỆU .............................................................................................................17

1.1. Danh mục các phần mềm và trang web được sử dụng: .............................17

1.2. Mẫu thí nghiệm ..............................................................................................18

1.3. Thiết bị ............................................................................................................18

1.4. Hoá chất ..........................................................................................................18

1.4.1. Hoá chất cần thiết cho quy trình tách chiết..............................................18

1.4.2. Hoá chất cần thiết cho quy trình PCR và điện di .....................................18

1.4.3. Hoá chất cần thiết cho quy trình tách chiết RNA và chuyển đổi cDNA ...18

Nghiên cứu khoa học ii

SVTH: Nguyễn Hoàng Nhật Minh

2. PHƯƠNG PHÁP...................................................................................................19

2.1. Chọn lọc và trích xuất dữ liệu.......................................................................19

2.2. Phân tích thống kê tổng hợp .........................................................................19

2.3. Thu nhận và đánh giá các thông số vật lý và độ đặc hiệu của các cặp mồi

mRNA BARTs..........................................................................................................19

2.4. Quy trình nghiên cứu thực nghiệm ..............................................................20

2.4.1. Tách chiết RNA tổng số bằng bộ kit GeneJET RNA Purification Kit

(Thermofisher) .......................................................................................................20

2.4.2. Chuyển RNA tổng số thành cDNA bằng SensiFAST™ cDNA Synthesis Kit

(Bio line) ................................................................................................................22

2.4.3. Sử dụng phương pháp Realtime-PCR khuếch đại trình tự mục tiêu.........22

2.5. Phân tích kết quả thực nghiệm.....................................................................22

1. KẾT QUẢ KHẢO SÁT IN SILICO CƠ SỞ DỮ LIỆU.....................................24

1.1. Kết quả trích xuất dữ liệu .............................................................................24

1.2. Kết quả thống kê tổng quan các công trình nghiên cứu.............................25

1.3. Tần số phát hiện mRNA BARTs ..................................................................27

1.4. Phương pháp phát hiện mRNA BARTs ......................................................30

1.5. Các loại mẫu được sử dụng để phát hiện mRNA BARTs..........................30

1.6. Phân tích tổng hợp (meta-analysis) mối tương quan giữa tỉ lệ phát hiện

mRNA BARTs và loại mẫu .....................................................................................31

1.7. Phân tích mối tương quan giữa tỉ lệ phát hiện mRNA BARTs với loại

mẫu thông qua biểu đồ ............................................................................................33

2. ĐÁNH GIÁ CÁC THÔNG SỐ VẬT LÝ VÀ ĐỘ ĐẶC HIỆU CỦA CÁC CẶP

MỒI...............................................................................................................................35

2.1. Thu nhận trình tự của các cặp mồi mRNA BARTs....................................35

2.2. Kết quả kiểm tra thông số vật lý của các cặp mồi ......................................36

2.3. Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của mồi .........................................................40

2.3.1. Kiểm tra độ đặc hiệu và sự bắt cặp của mồi bằng Annhyb ......................40

2.3.2. Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của mồi bằng BLAST .................................44

3. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM...............................................................................48

3.1. Kết quả khuếch đại mRNA BARTs.................................................................48

3.1.1. Kết quả khuếch đại trình tự mRNA BARF0 ..............................................48

3.1.2. Kết quả khuếch đại mRNA RPMS1 ...........................................................52

Nghiên cứu khoa học iii

SVTH: Nguyễn Hoàng Nhật Minh

3.1.3. Kết quả khuếch đại mRNA A73.................................................................57

3.1.4. Kết quả khuếch đại mRNA GAPDH..........................................................61

3.2. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THỐNG KÊ ............................................................65

3.2.1. Kết quả phân tích thống kê tần số phát hiện mRNA BARTs.....................65

3.2.2. Phân tích sự biểu hiện mRNA BARTs.......................................................70

3.2.3. Phân tích mối tương quan giữa các yếu tố nguy cơ và tỉ lệ nhiễm UTVH ở

các mẫu nghiên cứu. ...............................................................................................75

1. KẾT LUẬN............................................................................................................78

1.1. Kết quả khảo sát in silico...............................................................................78

1.2. Kết quả thực nghiệm .....................................................................................78

2. KIẾN NGHỊ...........................................................................................................79

TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................................81

PHỤ LỤC .....................................................................................................................85

Nghiên cứu khoa học iv

SVTH: Nguyễn Hoàng Nhật Minh

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1. Hình vẽ minh hoạ giải phẫu khu vực đầu và cổ của người ............................3

Hình 1.2. Sự phân bố tỉ lệ mắc UTVH năm 2002 ở nam và nữ ......................................4

Hình 1.3. Biểu đồ cột thể hiện tỉ lệ nhiễm UTVH và tử vong ở châu Á .........................5

Hình 1.4. Sơ đồ thể hiện các yếu tố nguy cơ gây UTVH ................................................6

Hình 2.1. a) Sơ đồ bộ gen EBV dạng vòng; b) Sơ đồ bộ gen EBV dạng thẳng .............8

Hình 2.2. Con đường tín hiệu của Notch ở tế bào.........................................................10

Hình 2.3. Sơ đồ thể hiện mối quan hệ trong con đường tín hiệu RACK1 ....................11

Hình 3.1. Kỹ thuật Polymerase Chain Reaction (PCR) ................................................13

Hình 3.2. Kỹ thuật reverse transcription PCR (RT-PCR).............................................14

Hình 3.3. Biểu đồ khuếch đại của Realtime-PCR .........................................................16

Hình 3.4. Chu trình nhiệt cho phản ứng chuyển đổi cDNA ..........................................22

Hình 4.1. Sơ đồ mô tả quy trình chọn lọc công trình nghiên cứu cho phân tích tổng

hợp .................................................................................................................................24

Hình 4.2. Trung bình trọng số phát hiện các mRNA BARTs.........................................29

Hình 4.3. Biểu đồ phễu thể hiện tần số phát hiện mRNA BARTs ở mẫu mô.................34

Hình 4.4. Biểu đồ rừng thể hiện tần số phát hiện mRNA BARTs ở mẫu mô.................34

Hình 5.1. Chu trình nhiệt khuếch đại cDNA bằng phương pháp Realtime-PCR..........39

Hình 5.2. Kết quả Annhyb cặp mồi BARF-LLW5 và BARF-2.......................................40

Hình 5.3. Kết quả Annhyb cặp mồi RPMS1-5 và RPMS1-6..........................................41

Hình 5.4. Kết quả Annhyb cặp mồi Exon5-7 và Exon3B-5 ...........................................42

Hình 5.5. Kết quả Annhyb cặp mồi GAPDH-F và GAPDH-R......................................43

Hình 5.6. Kết quả BLAST của mồi mRNA BARF-LLW5 và BARF-2 ............................44

Hình 5.7. Kết quả BLAST của mồi mRNA RPMS1-5,6 .................................................45

Hình 5.8. Kết quả BLAST cặp mồi mRNA Exon5-7 và Exon3B-5.................................46

Hình 5.9. Kết quả BLAST mô tả cặp mồi GAPDH-F, R................................................47

Hình 5.10. Kết quả BLAST cặp mồi GAPDH-F, R........................................................47

Hình 6.1. Biểu đồ khuếch đại mRNA BARF0 của 15 mẫu bệnh....................................49

Hình 6.2. Đường cong nhiệt độ nóng chảy mRNA BARF0 của 15 mẫu bệnh...............50

Hình 6.3. Đỉnh nhiệt độ nóng chảy mRNA BARF0 của 15 mẫu bệnh...........................50

Hình 6.4. Kết quả điện di sản phẩm Realtime-PCR mRNA BARF0 của 15 mẫu bệnh .51

Hình 6.5. Kết quả giải trình tự và BLAST sản phẩm khuếch đại mRNA BARF0..........51

Hình 6.6. Kết quả sắp gióng cột trình tự sản phẩm mRNA BARF0 ..............................52

Hình 6.7. Biểu đồ khuếch đại mRNA RPMS1 của 15 mẫu bệnh ...................................53

Hình 6.8. Đường cong nhiệt độ nóng chảy mRNA RPMS1 của 15 mẫu bệnh ..............54

Hình 6.9. Đỉnh nhiệt độ nóng chảy mRNA RPMS1 của 15 mẫu bệnh ..........................54

Hình 6.10. Kết quả điện di sản phẩm Realtime-PCR mRNA RPMS1 15 mẫu bệnh .....55

Hình 6.11. Kết quả giải trình tự và BLAST sản phẩm khuếch đại mRNA RPMS1 .......56

Hình 6.12. Kết quả sắp gióng cột trình tự sản phẩm mRNA RPMS1............................57

Hình 6.13. Biểu đồ khuếch đại mRNA A73 của 6 mẫu bệnh và 4 mẫu lành .................58

Nghiên cứu khoa học v

SVTH: Nguyễn Hoàng Nhật Minh

Hình 6.14. Đỉnh nhiệt độ nóng chảy mRNA A73 của 6 mẫu bệnh và 4 mẫu lành ........58

Hình 6.15. Kết quả điện di sản phẩm Realtime-PCR mRNA A73 của 6 mẫu bệnh và 4

mẫu lành ........................................................................................................................59

Hình 6.16. Kết quả giải trình tự và BLAST sản phẩm khuếch đại mRNA A73 .............60

Hình 6.17. Kết quả sắp gióng cột trình tự sản phẩm mRNA A73 .................................60

Hình 6.18. Biểu đồ khuếch đại mRNA GAPDH của 13 mẫu lành ................................61

Hình 6.19. Đỉnh nhiệt độ nóng chảy mRNA GAPDH của 13 mẫu lành........................62

Hình 6.20. Đường cong nhiệt độ nóng chảy mRNA GAPDH của 13 mẫu lành............62

Hình 6.21. Kết quả điện di sản phẩm Realtime-PCR mRNA GAPDH 13 mẫu lành.....63

Hình 6.22. Kết quả giải trình tự và BLAST sản phẩm khuếch đại mRNA GAPDH ......64

Hình 6.23. Kết quả sắp gióng cột trình tự sản phẩm mRNA GAPDH ..........................64

Hình 7.1. Biểu đồ cột thể hiện tính tương quan giữa mức độ biểu hiện mRNA BARTs ở

mẫu bệnh so với mẫu lành.............................................................................................74

Hình 7.2. Biểu đồ thể hiện mối tương quan giữa độ tuổi và tần số phát hiện mRNA

BARTs............................................................................................................................76

Nghiên cứu khoa học vi

SVTH: Nguyễn Hoàng Nhật Minh

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1. Các nghiên cứu về mRNA BARTs liên quan đến nhiều loại ung thư khác

nhau trên thế giới ..........................................................................................................25

Bảng 1.2. Các công trình và tần số phát hiện mRNA BARTs ở các dòng tế bào..........27

Bảng 1.3. Các công trình và tần số phát hiện mRNA BARTs ở mô sinh thiết...............28

Bảng 1.4. Kết quả trung bình trọng số của các mRNA BARTs.....................................28

Bảng 1.5. Phương pháp được sử dụng để phát hiện và định lượng mRNA BARTs......30

Bảng 1.6. Các loại mẫu sử dụng trong nghiên cứu.......................................................30

Bảng 1.7. Phân tích tính tương quan giữa việc phát hiện một trong ba loại mRNA

BARTs với các mẫu mô liên quan đến EBV ..................................................................31

Bảng 1.8. Phân tích tính tương quan giữa việc phát hiện một trong ba loại mRNA

BARTs với các mẫu dòng tế bào nuôi cấy liên quan đến EBV......................................32

Bảng 2.1. Các cặp mồi BARTs được sử dụng trong nghiên cứu...................................36

Bảng 2.2. Bảng thông số vật lý của mồi mRNA BARTs ................................................37

Bảng 2.3. Giá trị nhiệt độ bắt cặp và thời gian kéo dài trong phản ứng ......................39

Bảng 3.1. Kết quả phân tích thống kê phát hiện mRNA BARTs....................................65

Bảng 3.2. Kết quả phân tích thống kê kết hợp các mRNA BARF0 theo từng nhóm......68

Bảng 3.3. Giá trị định lượng của mRNA BARTs ở mẫu bệnh .......................................70

Bảng 3.4. Giá trị định lượng của mRNA BARTs ở mẫu lành........................................71

Bảng 3.5. Giá trị tính toán sự biểu hiện mRNA bằng công thức 2-∆∆Ct

.........................73

Bảng 3.6. Phân tích thống kê mối tương quan giữa giới tính và tần số phát hiện mRNA

BARTs............................................................................................................................75

Bảng 3.7. Phân tích thống kê mối tương quan giữa độ tuổi và tần số phát hiện mRNA

BARTs............................................................................................................................76

Nghiên cứu khoa học vii

SVTH: Nguyễn Hoàng Nhật Minh

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ASR Age-Specific Rate

BART BamHI-A rightward transcript

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

Bp Base pair

CBF1 C-repeat/DRE binding factor 1

cDNA Complementary DNA

CDS Coding sequence

Cq Quantification cycle

CSL CBF1, Suppressor of Hairless, Lag-1

DNA Deoxyribonucleic acid

EBER Epstein-Barr virus encoded small RNA

EBV Epstein-Barr Virus

GAPDH Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

HLA Human leukocyte antigen

IARC International Agency for Research on Cancer

IDT Integrated DNA Technologies

IgA Immunoglobulin A

LCLs Lymphoblastoid cell lines

mRNA Messenger ribonucleic acid

NCBI National Center for Biotechnology Information

ORF Open Reading Frame

PCR Polymerase chain reaction

RACK1 Receptor for activated C kinase1

RefSeq Reference Sequence

RNA Ribonucleic acid

Nghiên cứu khoa học viii

SVTH: Nguyễn Hoàng Nhật Minh

Realtime-PCR PCR thời gian thực

RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction

Ta Annealing temperature

Tm Melting temperature

UTR Untranslated region

UTVH Ung thư vòm họng

WHO World Health Organization