Khảo sát sự hiện diện của các gen EBNA-1 và LMP-q của EPSREIN-BAR VIRUS trên bệnh ung thư vòm họng ở người Việt Nam

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN

THAM GIA XÉT GIẢI THƯỞNG CẤP TRƯỜNG

Tên đề tài:

KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA CÁC GEN EBNA-1 VÀ

LMP-1 CỦA EPSREIN-BARR VIRUS TRÊN BỆNH UNG

THƯ VÒM HỌNG Ở NGƯỜI VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH VI SINH-SINH HỌC PHÂN TỬ

TP.HCM, tháng 02 năm 2016

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN

THAM GIA XÉT GIẢI THƯỞNG CẤP TRƯỜNG

Tên đề tài:

KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA CÁC GEN EBNA-1 VÀ

LMP-1 CỦA EPSREIN-BARR VIRUS TRÊN BỆNH UNG

THƯ VÒM HỌNG Ở NGƯỜI VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH VI SINH-SINH HỌC PHÂN TỬ

Sinh viên thực hiện 1: Ngô Đông Kha Nữ Năm 04/04 Lớp DH12SH01

Sinh viên thực hiện 2: Hồ Tá Giáp Nam Năm 04/04 Lớp DH12SH01

Sinh viên thực hiện 3: Thiều Hồng Huệ Nữ Năm 04/04 Lớp DH12SH02

Sinh viên thực hiện 4: Nguyễn Thị Hương Nữ Năm 04/04 Lớp DH12SH01

Sinh viên thực hiện 5: Nguyễn Hải Châu Nam Năm 04/04 Lớp DH12SH03

Giảng viên hướng dẫn: ThS Lao Đức Thuận

TP.HCM, tháng 02 năm 2016

i

MỤC LỤC

DANH MỤC VIẾT TẮT....................................................................................................ix

ĐẶT VẤN ĐỀ .....................................................................................................................1

PHẦN I ................................................................................................................................2

1.TỔNG QUAN VỀ UNG THƢ .........................................................................................3

1.1.Khái niệm về ung thƣ.....................................................................................................3

1.2.Tình hình ung thƣ trên thế giới và Việt Nam ................................................................3

2.TỔNG QUAN VỀ UNG THƢ VÒM HỌNG ..................................................................3

2.1.Sơ lƣợc về ung thƣ vòm họng........................................................................................3

2.2.Tình hình ung thƣ vòm họng trên thế giới và Việt Nam ...............................................4

2.3.Tác nhân gây bệnh ung thƣ vòm họng...........................................................................5

3.EPSTEIN-BARR VIRUS (EBV) .....................................................................................6

3.1.Tổng quan về Epstein-Barr virus...................................................................................6

3.2.Cơ chế xâm nhiễm của EBV..........................................................................................7

3.3.Cấu trúc các gen.............................................................................................................7

3.3.1.Gen EBNA-1 (Epstein-Barr Nuclear Antigen-1)........................................................7

3.3.2.Gen EBNA-2 (Epstein-Barr Nuclear Antigen-2)........................................................9

3.3.3.Gen LMP-1 (Lantent membrane protein-1)................................................................9

3.3.4.Gen LMP-2(Lantent membrane protein-1)...............................................................11

3.3.5.Gen BALF5 ...............................................................................................................11

4.PHƢƠNG PHÁP POLYMERASE CHAIN REACTION..............................................11

PHẦN II.............................................................................................................................13

1.VẬT LIỆU ......................................................................................................................14

ii

1.1.Các phần mềm và trang web đƣợc sử dụng.................................................................14

1.2.Mẫu thí nghiệm............................................................................................................14

1.3.Dụng cụ - thiết bị - hóa chất ........................................................................................15

1.3.1.Dụng cụ.....................................................................................................................15

1.3.2.Thiết bị......................................................................................................................15

1.3.3.Hóa chất ....................................................................................................................15

1.4.Tiến trình nghiên cứu thực nghiệm..............................................................................16

2.PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................................................................16

2.1.Khai thác cơ sở dữ liệu ................................................................................................16

2.2.Khảo sát in silico..........................................................................................................17

2.3.Quy trình thực nghiệm.................................................................................................17

2.3.1.Tách chiết DNA theo phƣơng pháp Phenol/Chloroform..........................................17

2.3.2.Kiểm tra độ tinh sạch của sản phẩm DNA đã tách chiết ..........................................18

2.3.3.Khuếch đại trình tự gen mong muốn. .......................................................................19

2.3.4.Giải trình tự và so sánh với cơ sở dữ liệu.................................................................19

PHẦN III............................................................................................................................20

1.KẾT QUẢ KHẢO SÁT CƠ SỞ DỮ LIỆU....................................................................21

1.1.Kết quả khảo sát in silico.............................................................................................21

1.2.Kết quả khảo sát mồi. ..................................................................................................28

1.2.1.Kết quả kiểm tra thông số vật lý của các cặp mồi ....................................................28

1.2.2.Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của các cặp mồi .........................................................30

1.3.Chu trình nhiệt tham khảo ...........................................................................................33

2.KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM..........................................................................................34

iii

2.1.Kết quả tinh sạch DNA................................................................................................34

2.2.Kết quả tối ƣu hóa quy trình ........................................................................................35

2.2.1.Kết quả tối ƣu hóa quy trình phát hiện gen LMP-1. .................................................35

2.2.2.Kết quả tối ƣu hóa quy trình phát hiện gen LMP-2. .................................................37

2.2.3.Kết quả tối ƣu hóa quy trình phát hiện gen EBNA-1. ...............................................38

2.2.4.Kết quả tối ƣu hóa quy trình phát hiện gen EBNA-2. ...............................................39

2.2.5.Kết quả tối ƣu hóa quy trình phát hiện gen BALF5..................................................41

2.3.Kết quả khuếch đại trình tự gen...................................................................................42

2.3.1.Kết quả khuếch đại gen EBNA-1 ..............................................................................42

2.3.2.Kết quả khuếch đại gen EBNA-2 ..............................................................................44

2.3.3.Kết quả khuếch đại gen LMP-1. ...............................................................................45

2.3.4.Kết quả khuếch đại gen LMP-2. ...............................................................................47

2.3.5.Kết quả khuếch đại gen BALF5. ...............................................................................49

3.KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THỐNG KÊ ...........................................................................52

4.KẾT LUẬN.....................................................................................................................57

4.1.Kết quả khảo sát in silico.............................................................................................57

4.2.Kết quả thực nghiệm....................................................................................................58

4.3. Công trình nghiên cứu đƣợc công bộ .........................................................................57

4.4. Các hội nghị khoa học tham .......................................................................................57

PHẦN IV ..............................................................................................................................60

1.THẢO LUẬN.................................................................................................................59

2.ĐỀ NGHỊ .......................................................................................................................60

TÀI LIỆU THAM KHẢO....................................................................................................61

iv

PHỤ LỤC .............................................................................................................................70

v

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1. Giải phẫu vòm họng ........................................................................................4

Hình 1.2. Tỷ lệ mắc phải và tử vong của các loại ung thƣ tại Việt Nam ........................4

Hình 1.3. Bản đồ hệ gen của EBV dạng episome. ..........................................................6

Hình 1.4. Cấu trúc của protein EBNA1...........................................................................8

Hình 1.5. Cấu trúc của protein EBNA2...........................................................................9

Hình 1.6. Cấu trúc của protein LMP1. ..........................................................................10

Hình 1.7. Nguyên tắc của phƣơng pháp PCR................................................................12

Hình 2.1. Tiến trình nghiên cứu thì nghiệm ..................................................................16

Hình 3.1. Tần số phát hiện các gen LMP-1, LMP-2, EBNA-1, EBNA-2.......................25

Hình 3.2. Biểu đồ trung bình có trọng số loại mẫu sinh thiết và mẫu máu...................27

Hình 3.3. Kết quả Annhyb của cặp mồi EBNA1-F/EBNA1-R.....................................31

Hình 3.4. Kết quả Annhyb của cặp mồi EBNA2-F/EBNA2-R.....................................31

Hình 3.5: Kết quả Annhyb của cặp mồi LMP1-F/ LMP1-R.........................................32

Hình 3.6. Kết quả Annhyb của cặp mồi LMP2-F/ LMP2-R.........................................32

Hình 3.7. Kết quả Annhyb của cặp mồi BALF5-F/BALF5-R. .....................................33

Hình 3.8. Chu trình nhiệt chung của các gen. ...............................................................33

Bảng 3.9. Thông tin nhiệt độ bắt cặp và thời gian kéo dài các gen...............................34

Hình 3.9. Kết quả PCR lần 1, gen LMP-1 .....................................................................35

Hình 3.10. Kết quả PCR lần 2, gen LMP-1 ...................................................................36

Hình 3.11. Kết quả PCR lần 3, gen LMP-1 ...................................................................36

Hình 3.12. Kết quả PCR lần 1, gen LMP-2 ...................................................................37

Hình 3.13. Kết quả PCR lần 2, gen LMP-2 ...................................................................37

vi

Hình 3.14. Kết quả PCR lần 3, gen LMP-2 ...................................................................38

Hình 3.15. Kết quả PCR tối ƣu gen EBNA-1.................................................................38

Hình 3.16. Kết quả PCR lần 1, gen EBNA-2 .................................................................39

Hình 3.17. Kết quả PCR lần 2, gen EBNA-2 .................................................................40

Hình 3.18. Kết quả PCR lần 3, gen EBNA-2 .................................................................40

Hình 3.19. Kết quả PCR lần 4, gen EBNA-2 .................................................................41

Hình 3.20. Kết quả PCR tối ƣu gen BALF5 ..................................................................41

Hình 3.21. Kết quả khảo sát sự hiện diện của gen EBNA-1 trên mẫu bệnh và mẫu lành.

.......................................................................................................................................42

Hình 3.22. Kết quả giải trình tự gen EBNA-1-R............................................................43

Hình 3.23. Kết quả Blast trình tự giải trình tự gen EBNA-1 .........................................43

Hình 3.24. Kết quả khảo sát sự hiện diện của gen EBNA-2 trên mẫu bệnh và mẫu lành.

.......................................................................................................................................44

Hình 3.25. Kết quả giải trình tự gen EBNA-2-F............................................................45

Hình 3.26. Kết quả Blast trình tự giải trình tự gen EBNA-2 .........................................45

Hình 3.27. Kết quả khảo sát sự hiện diện của gen LMP1 trên mẫu bệnh và mẫu lành. 46

Hình 3.28. Kết quả giải trình tự gen LMP-1-F..............................................................46

Hình 3.30. Kết quả khảo sát sự hiện diện của gen LMP-2 trên mẫu bệnh và mẫu lành.

.......................................................................................................................................48

Hình 3.31. Kết quả giải trình tự gen LMP-2-F..............................................................48

Hình 3.32. Kết quả Blast trình tự giải trình tự gen LMP-2............................................49

Hình 3.33. Kết quả khảo sát sự hiện diện của gen BALF5 trên mẫu bệnh và mẫu lành.

.......................................................................................................................................49

Hình 3.34. Kết quả giải trình tự gen BALF5-R..............................................................50

vii

Hình 3.35. Kết quả khuếch đại gen LMP-1, LMP-2 cùng với chứng nội .................. 51

Hình 3.36. Kết quả khuếch đại gen EBNA-1, EBNA-2 cùng với chứng nội .............. 51

viii

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 3.1. Các công trình và tần số phát hiện gen LMP-1.............................................21

Bảng 3.2. Các công trình và tần số phát hiện gen LMP-2.............................................22

Bảng 3.3. Các công trình và tần số phát hiện gen EBNA-1...........................................23

Bảng 3.4. Các công trình và tần số phát hiện gen EBNA-2...........................................24

Bảng 3.5. Kết quả trung bình trọng số của các gen.......................................................24

Bảng 3.6. Tỉ lệ các phƣơng pháp đƣợc sử dụng để phát hiện các gen của EBV...........26

Bảng 3.7. Bảng trung bình có trọng số giữa mấu mô sinh thiết và mẫu máu ...............27

Bảng 3.8. Thông số vật lý của các cặp mồi. ..................................................................28

Bảng 3.9. Bảng nồng độ và DNA đƣợc tách chiết từ mẫu mô sinh thiết vòm họng.....34

Bảng 3.10. Kết quả phân tích thống kê của gen EBNA-1, EBNA-2, LMP-1, LMP-2 và

BALF5............................................................................................................................52

Bảng 3.11. Kết quả phân tích thống kê kết hợp hai gen EBNA-1 và EBNA-2 ..............54

Bảng 3.12. Kết quả phân tích thống kê kết hợp hai gen LMP-1 và LMP-2 ..................55

Bảng 3.13. Kết quả phân tích thống kê phát hiện đa gen. .............................................56

Bảng 3.14. Giá trị PI (PCR index).................................................................................57

ix

DANH MỤC VIẾT TẮT

AKT Protein kinase B.

AP1 Activator protein 1

ATF Activating transcription factor

B cell Bursal-derived cell

Bp Base pair

Bcl-2 B-cell lymphoma 2

BMP Bone morphogenetic protein

BRAM BMP receptor-associated molecule

Cdc42 Cell division cycle 42

cIAPs Cellular inhibitor of apoptosis

Cp C-promoter

CR Conserve region.

CTAR C-terminal activation regions

DNA Deoxyribo nucleic acid

DS Dyad symmetry

EBNA Epstein-Barr nuclear antigen

EBNA-LP Epstein-Barr nuclear antigen leader protein

EBV Epstein-Barr Virus

ERKs Extracellular-signal-regulated kinases

FR family of repeats

Gp glycoprotein

HHV Human herpesvirus

IKK IκB kinase

LCL Lymphoblastoid cell line

IR Internal reapeat

IκBα Nuclear factor (NF)-κB alpha

JNK c-Jun N-terminal kinases