Khảo sát sự đa dạng di truyền của nhóm vi khuẩn tích lũy poly-phosphate trong chất thải chăn nuôi heo và cá tra ở vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long và ứng dụng trong xử lý nước ao cá tra.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LÊ QUANG KHÔI

MSHV: 62031101

KHẢO SÁT ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NHÓM

VI KHUẨN TÍCH LŨY POLY-PHOSPHATE TRONG

CHẤT THẢI CHĂN NUÔI HEO VÀ CÁ TRA Ở

VÙNG ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG VÀ

ỨNG DỤNG TRONG XỬ LÝ NƯỚC AO CÁ TRA

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC

MÃ NGÀNH: 62 42 01 07

Năm 2015

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LÊ QUANG KHÔI

MSHV: 62031101

KHẢO SÁT ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NHÓM

VI KHUẨN TÍCH LŨY POLY-PHOSPHATE TRONG

CHẤT THẢI CHĂN NUÔI HEO VÀ CÁ TRA Ở

VÙNG ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG VÀ

ỨNG DỤNG TRONG XỬ LÝ NƯỚC AO CÁ TRA

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC

MÃ NGÀNH: 62 42 01 07

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

PGS. TS. TRƯƠNG TRỌNG NGÔN

GS. TS. CAO NGỌC ĐIỆP

Năm 2015

Luận án tốt nghiệp Tiến sĩ khoá 2011-2015 Trường Đại học Cần Thơ

Chuyên ngành Vi sinh vật học Vi i ện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của Nghiên cứu sinh Lê

Quang Khôi với sự hướng dẫn của PGS. TS. Trương Trọng Ngôn và GS.TS.

Cao Ngọc Điệp. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực,

chưa từng được công bố riêng lẻ bởi tác giả khác trong bất kỳ công trình nào

trước đây./.

Người hướng dẫn khoa học Tác giả luận án

PGS. TS. TRƯƠNG TRỌNG NGÔN LÊ QUANG KHÔI

GS. TS. CAO NGỌC ĐIỆP

Luận án tốt nghiệp Tiến sĩ khoá 2011-2015 Trường Đại học Cần Thơ

Chuyên ngành Vi sinh vật học Vi ii ện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học

LỜI CÁM ƠN

Với tất cả lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cám ơn PGS. TS Trương

Trọng Ngôn và GS. TS. Cao Ngọc Điệp đã tận tình hướng dẫn và giúp tôi hoàn

thành luận án này. Thầy là người truyền cho tôi lòng nhiệt huyết và thổi lên

ngọn lửa đam mê khoa học, khơi dậy trong tôi sự nỗ lực, tự tin, cố gắng không

ngừng và không nản lòng trước những khó khăn trong suốt tiến trình thực hiện

luận án tiến sĩ. Xin cám ơn Thầy đã dành nhiều thời gian, công sức và luôn giúp

tôi có được định hướng đúng đắn trong học tập và nghiên cứu.

Tiến trình hơn 3 năm thực hiện các thí nghiệm trong luận án, tôi đã luôn

được sự quan tâm, hỗ trợ của Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát triển

Công nghệ Sinh học-trường Đại học Cần Thơ, quý Thầy Cô đã giúp tôi có

thêm nhiều nghị lực để hoàn thành nội dung nghiên cứu.

Xin cám ơn:

Cán bộ phòng thí nghiệm Vi sinh vật môi trường-Viện Nghiên cứu và

Phát triển Công nghệ Sinh học; phòng Thí nghiệm chuyên sâu-Trường Đại

học Cần Thơ; phòng thí nghiệm Sinh học phân tử-Viện Công nghệ Sinh học￾Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, phòng thí nghiệm Sinh học

phân tử-Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học-Trường Đại học

Cần Thơ; phòng Thí nghiệm trọng điểm-trường Đại học Bách Khoa Thành

Phố Hồ Chí Minh đã hỗ trợ tôi thực hiện nội dung nghiên cứu.

Anh chị Nghiên cứu sinh, học viên Cao học và các em Sinh viên đã đồng

hành cùng tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu; đã chia sẽ những khó

khăn và khuyến khích, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.

Cuối cùng, xin được gởi lời biết ơn đến Sở Khoa học và Công nghệ,

Trung tâm Nghiên cứu Ứng dụng và Dịch vụ Khoa học Công nghệ Tiền Giang

đã sắp xếp công việc và tạo điều kiện thuận lợi về thời gian để tôi hoàn thành

kế hoạch học tập toàn khóa trong chương trình đào tạo tiến sĩ. Đặc biệt là đối

với gia đình đã dành cho tôi tất cả tình yêu và sự khuyến khích, ủng hộ tôi

trong chặng đường cam go để hoàn thành được luận án nghiên cứu này.

Chân thành cám ơn./.

Luận án tốt nghiệp Tiến sĩ khoá 2011-2015 Trường Đại học Cần Thơ

Chuyên ngành Vi sinh vật học Vi iii ện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học

TÓM TẮT

Vi khuẩn tích lũy poly-phosphate (poly-phosphate accumulating bacteria

-PAB) là nhóm vi khuẩn có vai trò quan trọng trong xử lý nước thải bằng con

đường sinh học. Chúng tích lũy lượng lớn poly-phosphate nội bào, góp phần

vào quá trình loại bỏ phốt-pho hòa tan trong nước.

Đề tài được thực hiện với mục tiêu khảo sát tính đa dạng di truyền nhóm

vi khuẩn có khả năng tích lũy poly-phosphate (poly-P) trong chất thải chăn

nuôi heo đã qua xử lý biogas và ao nuôi thâm canh cá tra ở các tỉnh ĐBSCL

bao gồm các khâu phân lập và tuyển chọn, phân tích tính đa dạng di truyền và

ứng dụng vào trong xử lýphốt-pho hoà tan.

Áp dụng phương pháp truyền thống và kỹ thuật sinh học phân tử hiện

đại để phân lập PAB. Kết quả có 439 dòng vi khuẩn phân lập từ 196 mẫu chất

thải, trong đó có 191 dòng phân lập từ 70 mẫu chất thải ao nuôi thâm canh cá

tra và 248 dòng phân lập từ 126 mẫu chất thải chăn nuôi heo. Qua tiến trình

tuyển chọn và mô tả các đặc tính sinh học của các dòng vi khuẩn có tiềm năng

tích lũy poly-phosphate, kết quả nghiên cứu đã tìm ra được 48 dòng vi khuẩn

có khả năng tích lũy hàm lượng poly-P nội bào cao với các đặc tính chủ yếu

như: chúng có dạng hình que hoặc que ngắn; chuyển động, dao động tại chỗ

hoặc không chuyển động; có sự hiện diện các hạt poly-P bắt màu đen khi quan

sát tế bào dưới kính hiển vi điện tử truyền quét; gen tích lũy poly-phosphate

hiện diện chủ yếu dưới dạng IIA và IIC; tiềm năng tích lũy poly-phosphate nội

bào từ 10-9 đến 10-12 mg poly-phosphate/tế bào.

Dựa trên trình tự gen 16S rRNA cho thấy PAB có sự đa dạng về thành

phần loài; 22/191 dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải ao nuôi thâm canh cá tra

nằm trong bốn lớp Bacilli, Actinobacteria, Beta-proteobacteria, Gamma￾proteobacteria; 26/248 dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải trại chăn nuôi heo

nằm trong 4 lớp Bacilli, Actinobacteria, Gramma-proteobacteria, Alpha￾proteobacteria. Các dòng vi khuẩn có quan hệ gần gũi với giống Bacillus

chiếm tỉ lệ cao (54%), nhưng dòng vi khuẩn có tiềm năng tích lũy poly-P cao

là Acinetobacter sp. trong lớp Gamma-proteobacteria; Rhodococcus sp. trong

lớp Actinobacteria và Ochrobactrum sp. trong lớp Alpha-proteobacteria.

Qua phân tích và so sánh tính đa dạng di truyền của 48 dòng vi khuẩn

cho thấy trình tự gen 16S rRNA có các vùng nucleotide biến thiên mạnh xen

kẽ với các vùng ít biến thiên, các vùng này tạo ra các đặc trưng về sự đa hình

và đa dạng trình tự nucleotide cho quần xã vi khuẩn tích lũy poly-P cao. Số vị

trí đa hình khác biệt trong quần xã là 82,02 với chỉ số đa hình trung bình

θ=0,11 và có sự biến thiên từ 0,06 đến 0,17. Trung bình sự khác biệt

Luận án tốt nghiệp Tiến sĩ khoá 2011-2015 Trường Đại học Cần Thơ

Chuyên ngành Vi sinh vật học Vi iv ện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học

nucleotide k=116,6 với chỉ số đa dạng nucleotide trung bình Pi=0,16 và có sự

biến thiên từ 0,07 đến 0,3. Sự biến thiên các chỉ số θ và Pi tạo nên các dạng

haplotype khác nhau trong quần xã vi khuẩn tích lũy poly-P, có 25 haplotype

(kiểu gen) được tạo ra từ 48 trình tự nucleotide. Sự khác nhau về cấu trúc của

các haplotype tạo nên sự đa dạng cao giữa chúng (Hd=0,91). Điều này làm

xuất hiện nhiều kiểu gen có tính biến dị di truyền và khả năng thích nghi với

môi trường sống trong quá trình tiến hóa của các dòng vi khuẩn có khả năng

tích lũy hàm lượng poly-P cao. So sánh sự đa dạng di truyền giữa hai quần xã

vi khuẩn phân lập ở hai địa điểm lấy mẫu, kết quả cho thấy tính đa dạng

nucleotide, đa dạng haplotype của các dòng vi khuẩn phân lập trong chất thải

chăn nuôi heo (Pi=0,16, h=14) thấp hơn và tính bảo tồn gen cao hơn các dòng

vi khuẩn phân lập trong chất thải ao nuôi cá tra (Pi=0,18, h=16). Đây là cơ sở

khoa học trong việc lựa chọn nguồn mẫu để phân lập và tuyển chọn các dòng

vi khuẩn tích lũy poly-P.

Thông qua quá trình tuyển chọn ban đầu từ tập hợp 20 dòng vi khuẩn

phân lập được, 2 dòng TGT013L và TGT025L có khả năng làm giảm hàm

lượng phosphate cao nhất trong nước thải tổng hợp từ 17,7 mg/L xuống còn

4,1 và 2,6 mg/L sau 25 giờ thí nghiệm, với hiệu suất loại bỏ phosphat tương

ứng là 76,5% và 85,3% (ở pH khoảng 8,1; chỉ số OD.600 nm khoảng 0,6). Tổ

hợp 2 dòng TGT013L+TGT025L cho hiệu quả loại bỏ phosphate hoà tan

trong nước ao nuôi cá tra xuống còn 0,5 mg/L với hiệu suất xử lý đạt 85,1%

sau 36 giờ cấy bổ sung vi khuẩn. Kết quả chụp TEM và PCR cho thấy 2 dòng

vi khuẩn này có gen đồng hóa phosphate thành dạng hạt poly-phosphate nội

bào. Chúng được xác định có mối quan hệ gần gũi với Acinetobacter

radioresistens (GU145275) và Kurthia sp. (JQ398850), cùng tỉ lệ tương đồng

với trình tự gen 16S rRNA trên Genbank, 99%. Hai dòng vi khuẩn này có

nhiều tiềm năng để xử lý phốt-pho hòa tan trong mô hình nuôi cá tra công

nghiệp có ứng dụng công nghệ vi sinh.

Từ khóa: Acinetobacter, Kurthia, chỉ số θ, chỉ số Pi, poly-phosphate, vi

khuẩn tích lũy poly-phosphate.

Luận án tốt nghiệp Tiến sĩ khoá 2011-2015 Trường Đại học Cần Thơ

Chuyên ngành Vi sinh vật học Vi v ện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học

SUMMARY

Poly-phosphate accumulating bacteria (PAB) is an important bacterial

group that can take up large amounts of phosphate and accumulate as

intracellular poly-phosphate, contributing to biological phosphorus removal in

waste-water treatment.

The thesis was conducted to survey a genetic diversity of PAB

community isolated from samples of water and sludge of intensive catfish

ponds and effluent water and sludge obtained from piggery waste-water

treated bio-digesters in the Mekong Delta, Vietnam included isolation and

selection, analysis of genetic diversity and application of PAB isolated to treat

soluble phosphorus.

PAB were isolated by using plating techniques and molecular biology

techniques. In a total of 439 isolates, there are 191 strains isolated from 70

water and sludge samples of intensive catfish ponds and 284 strains isolated

from 126 samples obtained from piggery waste-water treated bio-digesters.

Throughout the process of selection and description of biological

characteristics of 48 isolates that have the potential of accumulating

intracellular poly-phosphate shown main characters included shaped like a

rods or short rod-shaped; motile, twitching movements or non-motile;

expression of poly-phosphate electron dense granules within the cells under

TEM examination; accumulated poly-phosphate from poly-phosphate kinase

gene 1 type-IIA and IIC that synthesizes intracellular poly-phosphate granules;

the content of intracellular poly-phosphate varied from 10-9 to 10-12 mg/cell.

Based on the partial 16S rRNA genes of these isolates were sequenced

and compared with bacterial 16S rRNA genes in Genbank show that PAB

have a diversity of the composition of species, 22 strains isolated from

intensive catfish ponds included in four classes: Bacilli, Actinobacteria, Beta￾proteobacteria, Gamma-proteobacteria; and 26 strains isolated from piggery

waste-water treated bio-digesters included in four classes: Bacilli,

Actinobacteria, Alpha-proteobacteria, Gamma-proteobacteria. The strains

which related to Bacillus were dominant bacteria group constituted up to 54%

of all identified isolates, but high potential strains of accumulating poly￾phosphate are Acinetobacter sp. within class Gamma-proteobacteria;

Rhodococcus sp. within class Actinobacteria; Ochrobactrum sp. within class

Alpha-proteobacteria.

The process of analysis and comparison of genetic diversity of 48 isolates

showed 16S rRNA sequences have nucleotide regions of high variability

Luận án tốt nghiệp Tiến sĩ khoá 2011-2015 Trường Đại học Cần Thơ

Chuyên ngành Vi sinh vật học Vi vi ện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học

interspersed with nucleotide regions of low variability. These areas generate

characteristics included nucleotide polymorphisms and diversity among 16S

rRNA sequences of high poly-phosphate accumulating bacteria. Measurement

of the amount of DNA polymorphisms revealed the number of polymorphic

sites among DNA sequences was 82.02 with the mean of the number of

polymorphic sites was θ=0.11 and the variance of θ ranged from 0.06 to 0.17.

Average number of nucleotide differences was k=116.6 with the mean of

nucleotide diversity was Pi=0.16 and the variance of Pi ranged from 0.07 to 0.3.

The variation of θ and Pi index formed the different types of haplotype in

population of PAB. There were 25 haplotypes (genotypes) from 48 sequences.

The difference of the structure of haplotypes formed a high diversity between

them (Hd=0.91). The levels of haplotype diversity created many genotypes for

the genetic variation and the ability to adapt to the environment in the

evolutionary process of bacterial strains capable of high accumulating poly-P.

Comparison of genetic diversity between populations of bacteria isolated from

two sampling places, the results showed that the nucleotide and haplotype

diversity of the strains isolated in piggery waste-water treated biodigesters

(Pi=0.16, h=14) were lower and the genetic conservation was higher than

isolated strains in intensive catfish ponds (Pi=0.18, h=16). This is scientific

basis for the selection of the sample sources for the isolation and selection of

poly-phosphate accumulating strains.

Of the total 20 strains that were initial screen-test, 2 strains as TGT013L

and TGT025L were capable of reducing phosphate in the synthesis medium

from 17.7 to 4.1 and 2.6 mg PO4

3-/L respectively after 25 hours of experiment

with the efficiency phosphate removal of 76.6 and 85.3% respectively at pH

8.1 and OD.600 nm 0.6 approximately. The Acinetobacter radioresistens

TGT013L and Kurthia sp. TGT025L consortium have the removal efficiecy of

soluble phosphorous in catfish ponds reached 85.1% after 36 hours cultured.

Association of TEM and PCR confirmed that two isolates have poly￾phosphate kinase gene 1 type-IIA that synthesizes intracellular poly-phosphate

granules. These strains were related to sequences of Acinetobacter

radioresistens (99% identity) and Kurthia sp. (99% identity). Two isolates,

from this study, have application potential to reduce soluble phosphorus from

intensive catfish ponds that applied microbial biotechnology.

Keyword: Acinetobacter, Kurthia, θ index, Pi index, poly-phosphate, poly￾phosphate accumulating bacteria.

Luận án tốt nghiệp Tiến sĩ khoá 2011-2015 Trường Đại học Cần Thơ

Chuyên ngành Vi sinh vật học Vi vii ện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN...............................................................................................................i

LỜI CÁM ƠN.....................................................................................................................ii

TÓM TẮT..........................................................................................................................iii

SUMMARY .......................................................................................................................v

MỤC LỤC........................................................................................................................vii

DANH SÁCH BẢNG......................................................................................................xi

DANH SÁCH HÌNH.......................................................................................................xii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT.........................................................................................xv

CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU...............................................................................................1

1.1 Đặt vấn đề .................................................................................................... 1

1.2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu ................................................................ 2

1.2.1 Mục tiêu nghiên cứu ...............................................................................................2

1.2.2 Nội dung nghiên cứu...............................................................................................2

1.3 Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án .............. 3

1.4 Cách tiếp cận và giả thuyết khoa học .......................................................... 3

1.5 Kết cấu của luận án...................................................................................... 5

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.........................................................................6

2.1 Các dạng phốt-pho tồn tại trong tự nhiên .................................................... 6

2.2 Sự tích tụ P sinh học trong các lớp bùn trầm tích ở ao-hồ........................... 7

2.3 Tình hình chăn nuôi heo, cá tra ở ĐBSCL .................................................. 8

2.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về phân lập, tuyển chọn PAB 11

2.4.1 Ngoài nước..............................................................................................11

2.4.2 Trong nước..............................................................................................13

2.5 Thành phần quần xã vi khuẩn tích lũy poly-phosphate............................. 14

2.5.1 Tình hình nghiên cứu thành phần quần xã PAB trong nước thải..................14

2.5.2 Tình hình nghiên cứu thành phần quần xã PAB trong các ao hồ tự nhiên ..15

2.6 Phương pháp định tính và định lượng hàm lượng poly-P nội bào ............ 16

2.6.1 Định tính hạt poly-P nội bào...................................................................16

Luận án tốt nghiệp Tiến sĩ khoá 2011-2015 Trường Đại học Cần Thơ

Chuyên ngành Vi sinh vật học Vi viii ện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học

2.6.1.1 Kính hiển vi quang học huỳnh quang..................................................16

2.6.1.2 Kính hiển vi điện tử kết hợp với phân tích năng lượng phân tán ........17

2.6.2 Xác định hàm lượng poly-P nội bào.......................................................18

2.7 Cơ chế quá trình trao đổi chất của nhóm vi khuẩn PAB và sự điều hòa... 21

2.7.1 Cơ chế quá trình trao đổi chất của vi khuẩn tích lũy poly-P ..................21

2.7.2 Quá trình tổng hợp và điều hòa sự tổng hợp poly-phosphate ........................23

2.7.2.1 Các enzyme tham gia tổng hợp poly-P................................................24

2.7.2.2 Các enzyme tham gia phân giải poly-P ...............................................24

2.7.2.3 Ảnh hưởng của tỉ lệ giữa hàm lượng carbon và phosphate .................25

2.7.2.4 Ảnh hưởng pH và Mg2+ trên quá trình đồng hóa và dị hóa .................27

2.8 Cơ sở khoa học phân tích sự đa dạng di truyền ở vi khuẩn....................... 28

2.8.1 Phân tích mối quan hệ di truyền dựa trên trình tự gen 16S rRNA .........28

2.8.1.1 Gen rRNA trong phân tích mối quan hệ di truyền của vi khuẩn.........28

2.8.1.2 16S Ribosomal RNAs..........................................................................30

2.8.1.3 Phân tích mối quan hệ di truyền dựa trên gen 16S rRNA ...................30

2.8.2 Gen ppk1 trong phân tích mối quan hệ di truyền của PAB ....................32

2.8.3 Phân tích đa dạng di truyền ....................................................................33

2.8.3.1 Đa dạng trình tự Nucleotide.................................................................33

2.8.3.2 Đa dạng loài.........................................................................................34

2.9 Các biện pháp loại bỏ phosphate hòa tan trong nước................................ 35

2.9.1 Loại bỏ phốt-pho hòa tan bằng con đường hóa học.........................................35

2.9.2 Loại bỏ phốt-pho hòa tan bằng con đường sinh học........................................37

2.9.2.1 Quá trình loại bỏ phosphate trong hệ thống xử l ý nước thải ...............38

2.9.2.2 Sự kết hợp loại bỏ phosphate bằng hóa học và sinh học .....................41

2.9.2.3 Sự giống nhau giữa poly-P trong bùn hoạt tính và bùn lắng tụ...........42

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................44

3.1 Phương tiện nghiên cứu ............................................................................. 44

3.1.2 Địa điểm, thời gian nghiên cứu ..............................................................44

3.1.2.1 Thời gian nghiên cứu...........................................................................44

Luận án tốt nghiệp Tiến sĩ khoá 2011-2015 Trường Đại học Cần Thơ

Chuyên ngành Vi sinh vật học Vi ix ện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học

3.1.2.2 Địa điểm nghiên cứu............................................................................44

3.1.3 Thiết bị, hóa chất ....................................................................................44

3.1.3.1 Thiết bị, dụng cụ ..................................................................................44

3.1.3.2 Hóa chất ...............................................................................................45

3.2 Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 47

3.2.1 Chuẩn bị mẫu..........................................................................................47

3.2.1.1 Đối với mẫu chất thải ao nuôi thâm canh cá tra ..................................47

3.2.1.2 Đối với mẫu chất thải trại heo [sau hầm ủ biogas] ..............................48

3.2.2 Phân lập vi khuẩn....................................................................................49

3.2.3 Định tính hạt poly-P nội bào...................................................................50

2.2.4 Xác định hàm lượng poly-P nội bào.......................................................50

3.2.5 Nhận diện gen ppk1 ................................................................................51

3.2.6 Định danh PAB.......................................................................................52

3.2.7 Phân tích sự đa dạng vi khuẩn tích lũy poly-P .......................................53

3.2.8 Thí nghiệm kiểm tra sơ bộ khả năng loại bỏ phosphate hòa tan ............54

3.2.9 Thí nghiệm theo dõi sự biến đổi pH, OD.600nm ...................................54

3.2.10 Thí nghiệm kiểm tra hiệu suất loại bỏ phosphate qui mô 10 lít ...........56

3.2.11 Thí nghiệm kiểm tra hiệu suất loại bỏ phosphate qui mô 500 lít .........57

3.2.12 Đánh giá hiệu quả xử l ý của 2 dòng vi khuẩn PAB..............................58

3.2.13 Phương pháp xử lý số liệu ....................................................................60

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...............................................................61

4.1 Phân lập và xác định đặc điểm hình thái của vi khuẩn phân lập ............... 61

4.1.1 Kết quả phân lập .....................................................................................61

4.1.2 Đặc điểm các dòng vi khuẩn đã phân lập ...............................................64

4.1.3 Mô tả đặc tính sinh học của các dòng vi khuẩn PAB............................. 66

4.1.4 Nhận diện gen ppk1 ................................................................................77

4.2 Định danh và phân tích tính đa dạng PAB ................................................ 80

4.2.1 Định danh và phân tích sự phát sinh loài PAB trong ao nuôi cá tra.......80

4.2.2 Định danh và phân tích sự phát sinh loài PAB chất thải chăn nuôi heo.83

Luận án tốt nghiệp Tiến sĩ khoá 2011-2015 Trường Đại học Cần Thơ

Chuyên ngành Vi sinh vật học Vi x ện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học

4.2.3 Phân tích tính đa dạng di truyền của PAB..............................................92

4.2.3.1 Phân tích tính đa dạng nucleotide........................................................92

4.2.3.2 Phân tích tính đa dạng loài.................................................................103

4.3 Kết quả tuyển chọn các dòng vi khuẩn tích lũy poly-P........................... 104

4.3.1 Kết quả kiểm tra hiệu suất loại bỏ phosphate của 20 dòng vi khuẩn ...104

4.3.2 Sự biến đổi chỉ số pH và hàm lượng PO4

3- theo thời gian....................105

4.3.3 Sự biến đổi chỉ số OD.600 nm và hàm lượng PO4

3- theo thời gian......106

4.3.4 Kết quả loại bỏ phosphate trong nước ao nuôi cá tra ...........................110

4.3.4.1 Sự biến đổi hàm lượng PO4

3- theo thời gian qui mô 10 lít ................110

4.3.4.2 Sự biến đổi hàm lượng PO4

3- theo thời gian qui mô 500 lít ..............112

4.3.4.3 Đánh giá hiệu quả xử l ý PO4

3- vi khuẩn mô hình nuôi cá tra ............113

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT................................................................ 120

5.1 Kết luận.................................................................................................... 120

5.2 Đề nghị..................................................................................................... 121

TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................... 122

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ ............................................... 136

PHỤ LỤC 1: ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC DÒNG VI KHUẨN PHÂN LẬP ......... 137

Bảng PL1.1: Chỉ số pH và mật số vi khuẩn dị dưỡng của 196 mẫu.............. 137

Bảng PL1.2: Hình dạng 439 dòng vi khuẩn và hàm lượng poly-P nội bào... 147

PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ GEN 16S RNA .................................. 156

PHỤ LỤC 3: KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THỐNG KÊ CHỈ SỐ ĐA DẠNG ......... 159

PL3.1: Phân tích sự đa dạng nucleotide giữa 48 dòng .................................. 159

PL3.2: Phân tích sự đa dạng nucleotide giữa 22 dòng ................................. 159

PL3.3: Phân tích sự đa dạng nucleotide giữa 26 dòng .................................. 160

PHỤ LỤC 4: BẢNG THỐNG KÊ SỐ LIỆU THÍ NGHIỆM................................. 161

PHỤ LỤC 5: KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ANOVA..................................................... 163

PL5.1: Kết quả phân tích AGH006L, BTT006L, TGT013L, TGT025L............ 163

PL5.2: Kết quả phân tích TGT025, DC, TGT013, TGT013L+TGT025L .... 167

PL5.3: Kết quả phân tích TGT025, DC, TGT013, TGT013L+TGT025L .... 168

Luận án tốt nghiệp Tiến sĩ khoá 2011-2015 Trường Đại học Cần Thơ

Chuyên ngành Vi sinh vật học Vi xi ện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học

DANH SÁCH BẢNG

Bảng Tên bảng Trang

2.1: Các chất sử dụng và điều kiện ly trích poly-P (Eixler et al., 2005) .. 20

2.2: Cặp mồi đặc hiệu nhận diện gen ppk1 (He et al., 2007)....................... 25

2.3: Thành phần của ribosome của tế bào nhân sơ và nhân thật............... 29

2.4: Hóa chất thường dùng để trầm hiện ortho-phosphate. ...................... 36

2.5: Acid béo hòa tan được hình thành trong bể kỵ khí............................ 40

2.6: Cấu trúc phân tử các đơn vị cấu tạo nên PHAs ................................. 40

3.1: Cặp mồi đặc hiệu nhận diện gen ppk1 (He et al., 2007) 47

3.2: Trình tự primer nhận diện 16S rDNA vi khuẩn PAB........................ 47

4.1: Mật số vi khuẩn dị dưỡng (CFU/mL).................................................61

4.2: Kết quả phân lập các dòng vi khuẩn.................................................. 63

4.3: Tỷ lệ phần trăm về đặc điểm hình thái của các dòng vi khuẩn.......... 65

4.4: Tổng hợp kết quả kiểm tra hàm lượng poly-P nội bào...................... 66

4.5: Đặc điểm sinh học PAB phân lập từ chất thải ao nuôi cá tra .............. 67

4.6: Đặc điểm sinh học PAB phân lập trong chất thải chăn nuôi heo ...... 70

4.7: Hàm lượng poly-P nội bào vi khuẩn phân lập từ ao nuôi cá tra............ 75

4.8: Hàm lượng poly-P nội bào vi khuẩn từ chất thải chăn nuôi heo ....... 76

4.9: Kết quả định tên vi khuẩn phân lập trong nước ao nuôi cá tra.......... 82

4.10: Kết quả định tên vi khuẩn phân lập trong chất thải chăn nuôi heo ....... 85

4.11: Đa dạng nucleotide vùng gen 16S rRNA 48 dòng vi khuẩn ............. 94

4.12: Đa dạng nucleotide vùng gen 16S rRNA ........................................ 101

4.13: Chỉ số H′

và J

′

của 2 quần xã vi khuẩn tích lũy poly-P.................... 103

4.14: Hiệu suất loại bỏ phosphate của 20 dòng vi khuẩn ......................... 105

4.15: Tỉ lệ (%) giữa PO4

3-/TP và sự chênh lệch giữa hai nghiệm thức..... 118

4.16: Trọng lượng và tỉ lệ sống cá lúc thu hoạch ở hai nghiệm thức ....... 118

Luận án tốt nghiệp Tiến sĩ khoá 2011-2015 Trường Đại học Cần Thơ

Chuyên ngành Vi sinh vật học Vi xii ện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học

DANH SÁCH HÌNH

Hình Tên hình Trang

2.1: Cấu trúc phân tử ortho-phosphate......................................................... 6

2.2: Cấu trúc chuỗi pyro-phosphate (Ahlgren, 2006)................................. 6

2.3: Ảnh chụp TEM hạt poly-P vi khuẩn Pseudomonas putida CA-3......... 7

2.4: Cấu trúc của phân tử ATP (adenosin triphosphate)............................. 7

2.5: Ảnh chụp kính hiển vi điện tử truyền quét hạt poly-P và hạt PHAs . 12

2.6: Tổng P được cấu thành từ các thành phần P khác nhau .................... 19

2.7: Sự hiện diện các hạt poly-P................................................................. 21

2.8: Hiệu quả trích poly-P bằng nước lạnh, nước nóng và NaOH............ 21

2.9: Các đặc điểm sinh hóa chính trong quá trình EBPR............................... 22

2.10: Chuyển hoá acetate và glycogen thành PHB bởi PAB ....................... 22

2.11: Mối tương quan giữa tốc độ hấp thu phosphate và hàm lượng COD ..... 26

2.12: Sơ đồ mô tả sự đồng vận chuyển MgHPO4/H+

.................................... 27

2.13: Ribosome của prokaryote và eukaryote............................................. 29

2.14: Ribosomal RNA operon của E.coli ................................................... 29

2.15: Các ribosomal RNAs genes của eukaryotes...................................... 30

2.16: Giản đồ cho 16S rRNA nằm trên tiểu đơn vị nhỏ của ribosome....... 31

2.17: Biểu đồ các bước phân tích mối quan hệ di truyền ........................... 32

2.18: Chỉ số đa dạng Shannon (H′

) và chỉ số độ đồng đều (J

′

)....................... 34

2.19: Sơ đồ mô tả loại bỏ phốt-pho............................................................. 35

2.20: Hệ thống tăng cường loại bỏ phốt-pho sinh học ..................................... 39

2.21: Mô hình tóm tắt quá trình tích lũy poly-P sinh.................................. 42

3.1: Thu mẫu chất thải ao nuôi thâm canh cá tra (nước và bùn)………...48

3.2: Mẫu bùn và nước ao cá tra................................................................. 48

3.3: Thu mẫu chất thải chăn nuôi trại heo (sau biogas)............................ 48

3.4: Mẫu chất thải trại heo sau biogas ...................................................... 49

3.5: Sơ đồ tóm tắt các bước phân lập vi khuẩn ........................................... 49

3.6: Sơ đồ tóm tắt các bước trong quá trình ly trích poly-P ..................... 51

Luận án tốt nghiệp Tiến sĩ khoá 2011-2015 Trường Đại học Cần Thơ

Chuyên ngành Vi sinh vật học Vi xiii ện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học

3.7: Chu kỳ phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rRNA............................ 52

3.8: Bố trí các nghiệm thức....................................................................... 55

4.1: Mối tương quan pH chất thải chăn nuôi heo và mật số dưỡng …….62

4.2: Mối tương quan pH chất thải ao nuôi nuôi cá tra và mật số.............. 62

4.3: Hình dạng và kích thước các dòng vi khuẩn phân lập....................... 68

4.4: Khuẩn lạc PAB phân lập trong chất thải ao nuôi cá tra..................... 69

4.5: Khuẩn lạc PAB phân lập trong chất thải chăn nuôi heo.................... 71

4.6: Hình dạng và cấu trúc bên trong PAB trong nước ao nuôi cá tra...... 73

4.7: Hình dạng và cấu trúc bên trong PAB trong chất thải nuôi heo........ 74

4.8: Phổ điện di (1) sản phẩm PCR của gen 16S rRNA ........................... 77

4.9: Phổ điện di (2) sản phẩm PCR của gen 16S rRNA ........................... 78

4.10: Phổ điện di (3) sản phẩm PCR của gen 16S rRNA ........................... 78

4.11: Phổ điện di (4) sản phẩm PCR của gen 16S rRNA ........................... 78

4.12: Phổ điện di (5) sản phẩm PCR của gen 16S rRNA, gen ppk1........... 79

4.13: Phổ điện di sản phẩm PCR của gen ppk1 trên gel agarose 1,2 % ..... 79

4.14: Phổ điện di sản phẩm PCR của gen ppk1 trên gel agarose 1,2 %. .... 80

4.15: Cây phả hệ dựa trên trình tự 16S rRNA của 22 dòng vi khuẩn......... 81

4.16: Cây phả hệ dựa trên trình tự 16S rRNA của 26 dòng vi khuẩn......... 84

4.17: Tỉ lệ các lớp vi khuẩn phân lập từ nước ao nuôi cá tra...................... 87

4.18: Tỉ lệ các lớp vi khuẩn phân lập từ chất thải trại chăn nuôi heo......... 87

4.19: Cây phả hệ dựa trên trình tự 16S rRNA của 48 dòng vi khuẩn ............ 93

4.20: Sự biến thiên chỉ số Theta vùng nucleotide từ 100 đến 816.............. 95

4.21: Đa hình đoạn trình tự gen từ vị trí 112 đến 236 ................................ 96

4.22: Đa hình đoạn trình tự gen từ vị trí 277 đến 377 ................................ 97

4.23: Sự biến thiên chỉ số Pi vùng nucleotide vị trí từ 100 đến 816........... 98

4.24: Sự phân bố các dạng haplotype........................................................... 98

4.25: Sự đa hình nucleotide trên 25 haplotype của 48 dòng vi khuẩn.......... 99

4.26: Dạng haplotype dòng vi khuẩn có khả năng tích lũy poly-P cao .... 100