Khảo sát quá trình sinh tổng hợp lipid và carotenoid của Rhodotorula Mucilaginosa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN

KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP

LIPID VÀ CAROTENOID CỦA

RHODOTORULA MUCILAGINOSA.

MÃ SỐ: 19

Bình Dương, 04/2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN

KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH SINH TỔNG

HỢP LIPID VÀ CAROTENOID CỦA

RHODOTORULA MUCILAGINOSA.

Chủ nhiệm đề tài: Võ Thị Mỹ Dung

Khoa: Công nghệ sinh học

Các thành viên: Phạm Thị Hằng Nga

Huỳnh Thị Y Bình

Người hướng dẫn: Lý Thị Minh Hiền

Bình Dương, 04/2018

i

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ..................................................................................................................................... 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU...................................................................................... 4

1.1. Tổng quan về nấm men Rhodotorula ................................................................ 5

1.1.1. Phân loại ..................................................................................................... 5

1.1.2. Giới thiệu chung.......................................................................................... 5

1.1.3. Phân bố ....................................................................................................... 6

1.1.4. Hình thái, kích thước tế bào nấm men ........................................................ 7

1.1.5. Cấu tạo của nấm men Rhodotorula. ........................................................... 7

1.1.6. Sinh sản của nấm men Rhodotorula ........................................................... 9

1.1.7. Đặc điểm sinh hóa..................................................................................... 10

1.1.8. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy nấm men Rhodotorula ..... 10

1.1.9. Giá trị dinh dưỡng của sinh khối nấm men Rhodotorula ......................... 13

1.2. Tổng quan về Lipid......................................................................................... 14

1.2.1. Khái niệm về Lipid .................................................................................... 14

1.2.2. Cấu tạo ...................................................................................................... 15

1.2.3. Phân loại ................................................................................................... 16

1.2.4. Trạng thái tự nhiên và tính chất vật lý...................................................... 16

1.2.5. Vai trò của lipid ........................................................................................ 16

1.2.6. Lipid của vi sinh vật .................................................................................. 17

1.2.7. Acid béo không bão hòa đa nối đôi (PUFA-polyunsaturated fatty acid) . 18

1.3. Tổng quan về carotenoid.................................................................................. 20

ii

1.3.1. Định nghĩa................................................................................................. 20

1.3.2. Lịch sử của carotenoid.............................................................................. 20

1.3.3. Phân bố ..................................................................................................... 21

1.3.4. Cấu tạo ...................................................................................................... 21

1.3.5. Phân loại ................................................................................................... 22

1.3.6. Tính chất.................................................................................................... 23

1.3.7. Cơ chế sinh tổng hợp sắc tố carotenoid ở vi sinh vật. .............................. 24

1.3.8. Ứng dụng của carotenoid.......................................................................... 28

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..................................... 30

2.1. Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm .................................................... 31

2.2. Nguyên vật liệu – hóa chất – thiết bị ............................................................... 31

2.2.1. Nguyên vật liệu.......................................................................................... 31

2.2.2. Hóa chất – Thiết bị - Dụng cụ................................................................... 34

2.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................. 35

2.3.1. Quy trình nuôi cấy..................................................................................... 35

2.4. Bố trí các thí nghiệm........................................................................................ 37

2.4.1. Khảo sát quá trình sinh tổng hợp lipid của Rhodotorula mucilaginosa trên môi

trường bổ sung dịch thủy phân tinh bột khoai mì................................................... 37

2.4.2. Khảo sát quá trình sinh tổng hợp lipid của Rhodotorula mucilaginosa trên môi

trường bổ sung dịch thủy phân bắp nếp. ................................................................ 42

2.4.3. Khảo sát quá trình sinh tổng hợp carotenoid của Rhodotorula mucilaginosa.

………… .................................................................................................................. 47

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN.......................................... 53

iii

3.1. Kết quả các thí nghiệm khảo sát quá trình tích lũy sinh khối và sinh tổng hợp lipid

của Rhodotorula mucilaginosa trên môi trường bổ sung dịch thủy phân tinh bột khoai

mì…............................................................................................................................ 54

3.1.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ enzyme và thời gian đến quá trình

thủy phân tinh bột khoai mì. ................................................................................... 54

3.1.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân

tinh bột khoai mì. .................................................................................................... 55

3.1.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon (dịch thủy phân tinh bột

khoai mì, glycerol) đến khả năng tích lũy sinh khối của nấm men Rhodotorula

mucilaginosa........................................................................................................... 56

3.1.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát sự ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng tích lũy

sinh khối tế bào của Rhodotorula mucilaginosa. ................................................... 58

3.1.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát sự ảnh hưởng của tỉ lệ carbon / nitơ (C / N) đến quá

trình tích lũy sinh khối và sinh tổng hợp lipid của Rhodotorula mucilaginosa

………….….............................................................................................................. 59

3.2. Kết quả các thí nghiệm khảo sát quá trình tích lũy sinh khối và sinh tổng hợp lipid

của Rhodotorula mucilaginosa trên môi trường bổ sung dịch bắp thủy phân........... 61

3.2.1. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ enzyme và thời gian đến quá trình

thủy phân dịch bắp nếp........................................................................................... 61

3.2.2. Thí nghiệm 7: Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân

dịch bắp nếp............................................................................................................ 63

3.2.3. Thí nghiệm 8: Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon đến khả năng tích lũy

sinh khối của nấm men Rhodotorula mucilaginosa................................................ 63

3.2.4. Thí nghiệm 9: Khảo sát sự ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng tích lũy

sinh khối tế bào của Rhodotorula mucilaginosa trên môi trường bắp nếp............ 65

iv

3.2.5. Thí nghiệm10: Khảo sát sự ảnh hưởng của tỉ lệ carbon / nitơ (C / N) đến quá

trình tích lũy sinh khối và sinh tổng hợp lipid của Rhodotorula mucilaginosa trên môi

trường bắp nếp........................................................................................................ 66

3.3. Kết quả các thí nghiệm khảo sát quá trình tích lũy sinh khối và sinh tổng hợp

carotenoid của Rhodotorula mucilaginosa ................................................................ 68

3.3.1. Thí nghiệm 11: Khảo sát sự ảnh hưởng của nguồn carbon D-glucose đến quá

trình tích lũy sinh khối và sinh tổng hợp carotenoid của Rhodotorula mucilaginosa.

…………. ................................................................................................................. 68

3.3.2. Thí nghiệm 12: Khảo sát sự ảnh hưởng của nguồn carbon saccharose đến quá

trình tích lũy sinh khối và sinh tổng hợp carotenoid của Rhodotorula

mucilaginosa…….................................................................................................... 69

3.3.3. Thí nghiệm 13: Khảo sát sự ảnh hưởng của nguồn carbon glycerol đến quá

trình tích lũy sinh khối và sinh tổng hợp carotenoid của Rhodotorula

mucilaginosa…….................................................................................................... 70

3.3.4. Thí nghiệm 14: Khảo sát sự ảnh hưởng của nguồn carbon glycerol kết hợp với

D-glucose đến quá trình tích lũy sinh khối và sinh tổng hợp carotenoid của

Rhodotorula mucilaginosa...................................................................................... 71

3.3.5. Thí nghiệm 15: Khảo sát sự ảnh hưởng của nguồn nitơ đến quá trình tích lũy

sinh khối và sinh tổng hợp carotenoid của Rhodotorula mucilaginosa. ................ 72

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.............................................................................. 74

4.1. Kết luận............................................................................................................ 75

4.2. Kiến nghị.......................................................................................................... 76

TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................................. 77

PHỤ LỤC ...................................................................................................................... 80

v

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1. 1. Phân loại nấm Rhodotorula (Harison, 1927)................................................. 5

Bảng 1. 2. Bảng phân loại lipid ..................................................................................... 16

Bảng 1. 3. Sự phân bố và đặc điểm của carotenoid ở các sinh vật................................ 21

Bảng 1. 4. Một số nghiên cứu về sinh tổng hợp carotenoid từ nấm men Rhodotorula. 27

Bảng 2. 1. Bảng bố trí thí nghiệm nồng độ và thời gian thủy phân tinh bột khoai mì...37

Bảng 2. 2. Nghiệm thức thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến quá

trình thủy phân tinh bột khoai mì. ................................................................................. 39

Bảng 2. 3. Nghiệm thức thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon (dịch thủy phân

tinh bột khoai mì, glycerol) đến quá trình nuôi cấy nấm men Rhodotorula mucilaginosa.

....................................................................................................................................... 40

Bảng 2. 4. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nguồn nitơ đến quá trình tích lũy sinh khối và

sinh tổng hợp lipid......................................................................................................... 41

Bảng 2. 5. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của tỉ lệ C / N đến quá trình tích lũy sinh khối và

sinh tổng hợp lipid......................................................................................................... 42

Bảng 2. 6. Bảng bố trí thí nghiệm nồng độ và thời gian thủy phân dịch bắp................ 43

Bảng 2. 7. Nghiệm thức thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến quá

trình thủy phân dịch bắp. ............................................................................................... 44

Bảng 2. 8. Nghiệm thức thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon (dịch thủy phân

bắp, glycerol, D-glucose) đến quá trình nuôi cấy nấm men Rhodotorula mucilaginosa.

................................................................................................................................... …45

Bảng 2. 9. Bảng bố trí thí nghiệm tỉ lệ nitơ hữu cơ / vô cơ trên môi trường bắp nếp... 46

Bảng 2. 10. Bảng bố trí thí nghiệm C / N trên môi trường bắp nếp.............................. 47

Bảng 2. 11. Bố trí thí nghiệm hàm lượng D-glucose .................................................... 48

Bảng 2. 12. Bố trí thí nghiệm hàm lượng saccharose.................................................... 49

Bảng 2. 13. Bố trí thí nghiệm hàm lượng glycerol........................................................ 50

Bảng 2. 14. Bố trí thí nghiệm hàm lượng glycerol và D-glucose ................................. 51

Bảng 2. 15. Bố trí thí nghiệm hàm lượng các nguồn nitơ ............................................. 52

vi

Bảng 3. 1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng enzyme Termamyl SC Novozyme

và thời gian thủy phân đến quá trình thủy phân tinh bột khoai mì…………..………...54

Bảng 3. 2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến quá trình thủy phân tinh

bột khoai mì................................................................................................................... 55

Bảng 3. 3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nguồn carbon (dịch thủy phân tinh bột

khoai mì và glycerol) đến quá trình nuôi cấy nấm men Rhodotorula mucilaginosa. ... 57

Bảng 3. 4. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ (hữu cơ và vô cơ) đến quá trình nuôi

cấy nấm men Rhodotorula mucilaginosa...................................................................... 58

Bảng 3. 5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ carbon / nitơ (C / N) đến quá trình nuôi cấy

nấm men Rhodotorula mucilaginosa............................................................................. 59

Bảng 3. 6. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng enzyme Termamyl SC Novozyme

và thời gian thủy phân đến quá trình thủy phân dịch bắp. ............................................ 61

Bảng 3. 7. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến quá trình thủy phân dịch

bắp. ................................................................................................................................ 63

Bảng 3. 8. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nguồn carbon (dịch bắp, glucose và

glycerol) đến quá trình nuôi cấy nấm men Rhodotorula mucilaginosa. ....................... 64

Bảng 3. 9. Bảng kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng tích lũy sinh

khối tế bào của Rhodotorula mucilaginosa trên môi trường bắp nếp. .......................... 65

Bảng 3. 10. Khảo sát sự ảnh hưởng của tỉ lệ carbon / nitơ (C / N) đến quá trình tích lũy sinh

khối và sinh tổng hợp lipid của Rhodotorula mucilaginosa trên môi trường bắp nếp.. 66

Bảng 3. 11. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon D-glucose đến sự phát triển và

sinh tổng hợp carotenoid của Rhodotorula mucilaginosa............................................. 68

Bảng 3. 12. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon saccharose đến sự phát triển và

sinh tổng hợp carotenoid của Rhodotorula mucilaginosa............................................. 69

Bảng 3. 13. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon glycerol đến sự phát triển và

sinh tổng hợp carotenoid của Rhodotorula mucilaginosa............................................. 70

Bảng 3. 14. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon glycerol đến sự phát triển và

sinh tổng hợp carotenoid của Rhodotorula mucilaginosa............................................. 71

vii

Bảng 3. 15. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon glycerol đến sự phát triển và

sinh tổng hợp carotenoid của Rhodotorula mucilaginosa............................................. 72

viii

DANH MỤC HÌNH

Hình 1. 1. Tế bào nấm men Rhodotorula mucilaginosa qua kính hiển vi ..................... 5

Hình 1. 2. Khuẩn lạc Rhodotorula mucilaginosa......................................................... 7

Hình 1. 3. Một số thực phẩm giàu lipid .................................................................... 15

Hình 1. 4. Chất béo trong thực phẩm........................................................................ 17

Hình 1. 5. Phân tử acid béo không bão hòa đa (cis) ................................................. 18

Hình 1. 6. Công thức cấu tạo Linoleic acid............................................................... 19

Hình 1. 7. Phân loại carotenoid (Nguyễn Thị Minh Nguyệt, 2005). ........................ 22

Hình 1. 8. Con đường sinh tổng hợp carotenoid....................................................... 25

Hình 1. 9. Các phản ứng dehydro trong quá trình sinh tổng hợp carotenoid............ 26

Hình 1. 10. Tổng hợp carotenoid có vòng từ lycopene............................................. 26

Hình 2. 1. Trái bắp nếp mua tại chợ Thủ Dầu Một……………………………… 31

Hình 2. 2. Tinh bột khoai mì mua tại chợ Thủ Dầu Một .......................................... 32

Hình 2. 3. Khuẩn lạc chủng nấm men Rhodotorula mucilaginosa........................... 33

Hình 2. 4. Giữ giống trên môi trường thạch nghiêng................................................ 34

Hình 2. 5. Sơ đồ nuôi cấy nấm men Rhodotorula mucilaginosa trong môi trường lỏng.

................................................................................................................................... 35

Hình 2. 6. Sinh khối sau ly tâm................................................................................. 36

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

1. Thông tin chung:

- Tên đề tài: Khảo sát quá trình sinh tổng hợp lipid và carotenoid của Rhodotorula

mucilaginosa.

- Sinh viên thực hiện: Võ Thị Mỹ Dung

- Lớp: DH14SH01 Khoa: Công nghệ sinh học Năm thứ: 4

Số năm đào tạo: 4 năm.

- Người hướng dẫn: Lý Thị Minh Hiền

2. Mục tiêu đề tài:

- Khảo sát tìm ra điều kiện tối ưu cho quá trình thủy phân tinh bột khoai mì và bắp nếp.

- Khảo sát ảnh hưởng nguồn carbon (dịch thủy phân tinh bột khoai mì, dịch thủy phân

bắp nếp, D-glucose, glycerol, saccharose) đến quá trình nuôi cấy tăng sinh khối tế bào nấm

men Rhodotorula mucilaginosa.

- Khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ (vô cơ, hữu cơ) đến quá trình nuôi cấy tăng sinh

khối tế bào nấm men Rhodotorula mucilaginosa.

- Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ carbon / nitơ (C/N) đến quá trình sinh tổng hợp lipid của

Rhodotorula mucilaginosa.

3. Tính mới và sáng tạo:

Lipid là nguồn dinh dưỡng cần thiết cho cơ thể người. Hiện nay các sản phẩm lipid thực

phẩm có nguồn gốc từ thực vật hay từ cá biển. Nhằm đa dạng hóa nguồn thu nhận lipid và

tìm được loại lipid có giá trị sinh học, các nghiên cứu được thực hiện và bước đầu thu nhận

tín hiệu khả quan từ nguồn lipid vi sinh vật hay còn gọi là single cell oil.

Trong các loại vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp nấm men đỏ Rhodotorula thuộc

nhóm nấm men dầu (oleaginous yeast) có khả năng sinh tổng hợp lipid đồng thời còn tạo

ra hợp chất carotenoid làm cho sản phẩm thu nhận có thêm hoạt tính chống oxy hóa.

Đề tài này sử dụng chủng nấm men Rhodotorula mucilaginosa có nguồn gốc từ Việt

Nam và khảo sát ảnh hưởng các điều kiện dinh dưỡng nhằm tìm ra điều kiện sinh tổng hợp

lipid và carotenoid tối ưu của loại nấm men này. Trong quá trình khảo sát nhóm nghiên cứu

chọn nguồn dinh dưỡng rẻ tiền và phổ biến tại Việt Nam như tinh bột khoai mì và bắp nếp

nhằm giảm chi phí lên men. Với kết quả này sẽ bước đầu đánh giá khả năng ứng dụng của

loại nấm men này trong việc tạo nguồn sinh lipid mới ứng dụng trong công nghiệp nói

chung và công nghệ thực phẩm nói riêng.

4. Kết quả nghiên cứu:

- Tìm được điều kiện thủy phân tinh bột khoai mì và trích ly dịch bắp với Termamyl để

làm nguồn dinh dưỡng sinh tổng hợp lipid với Rhodotorula mucilaginosa.

- Tìm được thông số tối ưu trong quá trình sinh tổng hợp lipid trên môi trường tinh bột

khoai mì thủy phân: tỉ lệ dịch thủy phân tinh bột khoai mì và glycerol là (3 : 1); tỉ lệ nguồn

nitơ hữu cơ (yeast extract) và vô cơ ((NH4)2SO4) là (50 : 50), tỷ lệ C / N là 70 / 1.

- Tìm được thông số tối ưu trong quá trình sinh tổng hợp lipid trên môi trường bắp nếp

thủy phân: Thành phần môi trường nuôi bổ sung dịch bắp nếp (10g/L D-glucose, 10 g/L

Glycerol, 500ml dịch bắp, 5 g/L Yeast extract, 500 ml nước cất), tỷ lệ C / N là 80 / 1.

- Khảo sát ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng đến quá trình sinh tổng hợp carotenoid.

5. Đóng góp về mặt kinh tế - xã hội, giáo dục và đào tạo, an ninh, quốc phòng và khả

năng áp dụng của đề tài:

Kết quả đề tài sẽ trở thành tiền đề và tài liệu tham khảo cho các nghiên cứu nhằm đa

dạng hóa các nguồn lipid từ vi sinh vật với môi trường nuôi cấy rẻ tiền từ sản phẩm nông

nghiệp hay phụ phẩm nông nghiệp ở Việt Nam.

6. Công bố khoa học của sinh viên từ kết quả nghiên cứu của đề tài (ghi rõ tên tạp chí

nếu có) hoặc nhận xét, đánh giá của cơ sở đã áp dụng các kết quả nghiên cứu (nếu có):