Khai thác và phát triển nguồn gen vi sinh vật công nghiệp thực phẩm

BỘ CÔNG THƯƠNG

VIỆN CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI CẤP BỘ

KHAI THÁC VÀ PHÁT TRIỂN NGUỒN GEN

VI SINH VẬT CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

Chủ nhiệm đề tài: VŨ NGUYÊN THÀNH

7309

23/4/2009

HÀ NỘI - 2009

BỘ CÔNG THƯƠNG

VIỆN CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

-----------------

NHIỆM VỤ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ THƯỜNG XUYÊN

KHAI THÁC VÀ PHÁT TRIỂN NGUỒN GEN VI SINH VẬT

CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

Chủ nhiệm: PGS. TS. Vũ Nguyên Thành

Cộng tác viên ThS. Ngô Thanh Xuân (ĐH Sư phạm HN)

ThS. Dương Anh Tuấn (Viện CNTP)

CN. Nguyễn Thanh Thủy (Viện CNTP)

CN. Đào Anh Hải (Viện CNTP)

ThS. Đinh Mỹ Hằng (Viện CNTP)

ThS. Nguyễn Hương Giang (Viện CNTP)

TS. Mai Thị Hằng (ĐH Sư phạm HN)

Hà nội, tháng 12 năm 2008

- 1 -

MỤC LỤC

KÝ HIỆU VÀ VIẾT TẮT ............................................................................................................... 3

1. TỔNG QUAN ............................................................................................................................. 4

1.1. CƠ SỞ PHÁP LÝ/ XUẤT XỨ CỦA ĐỀ TÀI ......................................................................... 4

1.2. TÍNH CẤP THIẾT VÀ MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI ....................................... 4

1.3. ĐỐI TƯỢNG/PHẠM VI VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU .................................................... 4

1.4. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC ........................... 5

1.4.1. Axit phytic ............................................................................................................................. 5

1.4.2. Enzyme phân giải phytate (phytase) ...................................................................................... 6

1.4.2.1. Nguồn phytase .................................................................................................................... 7

1.4.2.2. Đặc điểm phytase ............................................................................................................... 9

1.4.2.3. Ứng dụng của phytase ...................................................................................................... 12

1.4.3. Nghiên cứu chuyển gene mã hóa phytase ........................................................................... 15

1.4.3.1. Gene mã hoá phytase ........................................................................................................ 15

1.4.3.2. Một số thành tựu chuyển gene mã hóa phytase ................................................................ 16

1.4.4. Hệ biểu hiện ......................................................................................................................... 20

1.4.4.1. Các hệ biểu hiện phổ biến................................................................................................. 20

1.4.4.2. Đặc điểm của hệ biểu hiện P. pastoris ............................................................................. 21

1.4.4.3. Cấu trúc vector biểu hiện ở P. pastoris ............................................................................ 22

1.4.4.4. Quá trình tiết protein ngoại bào ở P. pastoris .................................................................. 24

2. THỰC NGHIỆM ....................................................................................................................... 26

2.1. NGUYÊN LIỆU ..................................................................................................................... 26

2.1.1. Chủng vi sinh vật ................................................................................................................. 26

2.1.2. Plasmid ................................................................................................................................ 26

2.1.3. Hoá chất ............................................................................................................................... 26

2.1.4. Môi trường nuôi cấy và dung dịch đệm ............................................................................... 27

2.1.4.1. Môi trường nuôi cấy ......................................................................................................... 27

2.1.4.2. Dung dịch đệm ................................................................................................................. 27

2.1.5. Thiết bị ................................................................................................................................. 28

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................................................... 28

2.2.1. Tách chiết ADN ................................................................................................................... 28

2.2.1.1. Tách chiết ADN genome của Aspergillus và Pichia ........................................................ 28

2.2.1.2. Tách chiết plasmid ............................................................................................................ 28

2.2.2. PCR ...................................................................................................................................... 29

2.2.3. Xác định trình tự gene ......................................................................................................... 30

2.2.4. Ghép nối plasmid ................................................................................................................. 30

2.2.5. Biến nạp ADN ..................................................................................................................... 30

2.2.5.1. Biến nạp vào E. coli bằng sốc nhiệt ................................................................................. 30

2.2.5.2. Biến nạp P. pastoris bằng xung điện ................................................................................ 31

2.2.6. Tuyển chọn dòng mang gene biến nạp ................................................................................ 32

2.2.7. Biểu hiện gene trên P. pastoris ............................................................................................ 32

- 2 -

2.2.8. Xác định hoạt tính phytase .................................................................................................. 32

2.2.9. Phương pháp xác định protein tổng số (Bradford) .............................................................. 35

2.3. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ THẢO LUẬN ................................................................... 36

2.3.1. Thiết kế vector thể hiện phyA không chứa đuôi His-tag và C-myc-epitope (phyAs) ......... 38

2.3.1.1.Thiết kế mồi. ...................................................................................................................... 38

2.3.1.2. Nhân dòng gene ................................................................................................................ 39

2.3.1.3. Tinh sạch sản phẩm PCR ................................................................................................. 39

2.3.1.4. Gắn phyAs vào vector biểu hiện pPICZαA ..................................................................... 40

2.3.1.5. Kiểm tra sự có mặt của phyAs có trong E. coli bằng PCR colony ................................... 42

2.3.1.6. Tách chiết phasmid .......................................................................................................... 43

2.3.2. Kiểm tra trình tự của thiết kế mới tại các vị trí liên kết ...................................................... 44

2.3.3. Chuyển vector biểu hiện pPICZαA/phyAs vào P. pastoris ................................................ 45

2.3.3.1. Mở vòng pPICZαA/phyAs................................................................................................ 45

2.3.3.2. Biến nạp vector biểu hiện pPICZαA/phyAs/Pme I vào P. pastoris ................................. 46

2.3.4. Biểu hiện phyAs trên P. pastoris ......................................................................................... 48

2.3.5. Tuyển chọn chủng biến nạp có hoạt tính phytase cao ......................................................... 51

2.3.6. Tuyển chọn chủng biến nạp mang multicopy ...................................................................... 52

2.3.7. Xác định điều kiện lên men và thu hồi phytase ................................................................... 55

2.3.7.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ methanol ................................................................. 55

2.3.7.2. Ảnh hưởng của các môi trường và thời gian nuôi cấy đến khả năng biểu hiện phytase. . 56

2.3.8. Nghiên cứu so sánh đặc tính của phytase tái tổ hợp ............................................................ 59

3. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................................... 64

3.1. KẾT LUẬN ............................................................................................................................ 64

3.2. KIẾN NGHỊ ............................................................................................................................ 64

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................................. 65

PHỤ LỤC ...................................................................................................................................... 72

- 3 -

KÝ HIỆU VÀ VIẾT TẮT

AOX - Alcohol Oxidase

BSA - Bovine Serum Albumin

CNTP – Sưu tập giống vi sinh vật Viện Công nghiệp Thực phẩm

cDNA – Copy DNA

CS – Cộng sự

FIRI – Food Industries Research Institute (Viện Công nghiệp Thực phẩm)

ITS – Internal Transcribed Spacer

JCM – Japan Collection of Microorganisms (Bảo tàng giống Vi sinh vật Nhật Bản)

JICA - Japan International Cooperation Agency

KDa – Kilo Dalton

HIV – Human Immunodeficiency Virus

MALDI-TOF – Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time of Flight (kỹ thuật

khối phổ peptid dựa trên sự ion hóa bằng tia laser)

MW – Molecular weight (trọng lượng phân tử)

NMR - Nuclear Magnetic Resonance (cộng hưởng từ hạt nhân)

Mut – Methanol utilization

NRRL - Northern Regional Research Laboratory (hiện là National Center For

Agricultural Utilization Research) (Bảo tàng giống Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ)

OD - Optical Density (mật độ quang)

PAGE - Polyacrylamide Gel Electrophoresis (điện di polyacrylamide)

PCR - Polymerase Chain Reaction (phản ứng trùng hợp chuỗi)

PDA - Potato Dextrose Agar

Pvc – Phospho vô cơ

SDS- Sodium Dodecyl Sulfate

TCA - Trichloroacetic Acid

U - Unit (đơn vị)

- 4 -

1. TỔNG QUAN

1.1. CƠ SỞ PHÁP LÝ/ XUẤT XỨ CỦA ĐỀ TÀI

Đề tài được thực hiện theo hợp đồng nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ với

mã số: 07.08.QG/HĐ-KHCN giữa Bộ Công nghiệp và Viện Công nghiệp Thực phẩm ký

ngày 20/02/2008 (bản photo hợp đồng trang cuối). Trong quá trình thực hiện đề tài còn

nhận được sự hỗ trợ bổ sung từ SIDA/SAREC thông qua dự án “Nghiên cứu sử dụng phế

thải nông nghiệp để sản xuất enzyme vi sinh vật cho chăn nuôi gia súc, gia cầm ở Việt

Nam” do TS. Mai Thị Hằng (Đại học Sư phạm Hà Nội) làm chủ nhiệm.

1.2. TÍNH CẤP THIẾT VÀ MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

Phytase là một trong những enzyme có nhiều ứng dụng trong thực tiễn. Trong chăn

nuôi, bổ sung phytase riêng hoặc cùng với các enzyme khác đều làm tăng trọng lượng vật

nuôi. Phytase một mặt có tác dụng làm giảm tác động kháng dinh dưỡng của axit phytic,

làm giảm chi phí khẩu phần vì không cần thiết bổ sung phốt pho vô cơ vào trong thức ăn;

mặt khác làm giảm lượng phốt pho dư thừa thải qua phân, góp phần quan trọng vào

ngành chăn nuôi sạch và bền vững [Simell và CS., 1989].

Ngoài những ứng dụng quan trọng trong chăn nuôi, phytase bắt đầu được sử dụng trong

thực phẩm của người, điều chế các dẫn xuất myo-inositol phosphate cho ngành dược phẩm,

sử dụng trong công nghiệp giấy, ứng dụng cải tạo đất trồng [Ashima, 2000].

Trên thế giới, đã có rất nhiều nghiên cứu phytase của vi sinh vật, từ mức sơ bộ tuyển

chọn, nghiên cứu đặc tính đến mức phân tử nhân dòng, giải trình tự, biểu hiện gene, cung

cấp chủng giống tái tổ hợp cho sản xuất ở qui mô công nghiệp. Việt Nam sở hữu một

nguồn gene vi sinh vật phong phú nhưng chưa được khai thác một cách có hiệu quả. Một

trong những lý do là vi sinh vật phân lập từ môi trường nếu không qua chọn lọc, cải tạo sẽ

khó có thể ứng dụng được trong sản xuất công nghiệp. Những nghiên cứu về phytase ở

Việt Nam chỉ mới trong giai đoạn bắt đầu.

1.3. ĐỐI TƯỢNG/PHẠM VI VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Đề tài được thực hiện với nội dung chính là tách dòng gene mã hóa phytase từ vi sinh vật

đang bảo tồn lưu giữ nhằm cung cấp nguyên liệu di truyền cho việc tạo các chủng sinh

phytase tái tổ hợp phục vụ sản xuất. Đề tài bao gồm những phần công việc chính như sau:

- Thiết kế vector thể hiện phyA không chứa đuôi His-tag và c-myc-epitope

- Kiểm tra trình tự của thiết kế mới tại các vị trí liên kết

- Biến nạp đa bản phyA vào P. pastoris

- Thể hiện phyA trên P. pastoris

- Xác định điều kiện lên men và thu hồi phytase.

- 5 -

1.4. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC

1.4.1. Axit phytic

Axit phytic (myo-inositol 1,2,3,4,5,6 - hexakis dihydrogen phosphate; công thức hóa

học C6H18O24P6; phân tử lượng 659,86) là dạng dự trữ phốt pho chủ yếu ở các cây ngũ

cốc, cây họ đậu và các loại hạt chứa dầu. Axit phytic trong thực vật không tồn tại tự do

mà thường tạo muối phytate với một số nguyên tố khoáng như Mg, K, Ca, cũng như tham

gia liên kết với các protein.

Hình 1. Muối phytate và các liên kết với ion kim loại và protein.

Trong hạt cây, axit phytic có thể có những vai trò sinh lý như: (1) Nguồn dự trữ phốt

pho; (2) Nguồn dự trữ năng lượng; (3) Nguồn các ion dương (cation); (4) Nguồn cung

cấp myo-inositol. Ngoài ra, axit phytic có thể còn có một vài chức năng khác như là chất

chống oxy hóa trong giai đoạn nghỉ của hạt [Graf và CS., 1987].

Axit phytic về căn bản tồn tại dưới dạng muối của cation hóa trị một hay cation hoá

trị hai (ví dụ như muối K-Mg phytate có trong gạo và muối Ca-K-Mg phytate trong đậu

tương). Axit phytic thông thường được tổng hợp trong quá trình chín của hạt và xảy ra

đồng thời với sự tổng hợp các hợp chất tích trữ khác như tinh bột và lipid. Trong ngũ cốc

và cây họ đậu, axit phytic được tổng hợp trong hạt Alơron (Aleurone) và tinh thể hình

cầu [Reddy và CS., 1989]. Phytate hầu như không có mặt trong nội nhũ của lúa mỳ và

lúa nước mà tập trung trong mầm và trong lớp vỏ Alơron của tế bào hạt. Ở đậu Hà

Lan, 99% phytate của hạt tìm được trong lá mầm và 1% trong phôi mầm. Ngô là loại

ngũ cốc có hàm lượng phytate cao nhất (chiếm 0.83 – 2.22% khối lượng hạt). Trong

số các cây họ đậu, đậu dolique (dolique beans) có hàm lượng phytate cao nhất (5.92

– 9.15% khối lượng hạt) [Reddy và CS., 1989].

Axit phytic có hiệu ứng kháng dinh dưỡng rất mạnh đối với động vật. Do cấu

trúc phân tử đặc biệt (Hình 1), axit phytic có thể liên kết chặt chẽ với protein, các

nguyên tố khoáng và tạo thành phức hợp không tan trong đường tiêu hóa. Hiệu ứng

này dẫn đến ức chế quá trình tiêu hoá protein và hạn chế khả năng hấp thụ các ion