khả năng sinh kháng sinh kháng vi sinh vật từ xạ khuẩn

ðẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

VIỆN VI SINH VẬT VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

========000========

BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC HIỆN

ðỀ TÀI KHCN ðẶC BIỆT CẤP ðẠI HỌC QUỐC GIA

Tên ñề tài: ðiều tra, nghiên cứu một số hoạt chất có khả năng kháng vi sinh vật

và kháng dòng tế bào ung thư từ xạ khuẩn

Mã số: QG. 09. 48

Chủ trì ñề tài: TS. Nguyễn Huỳnh Minh Quyên

Cơ quan: Viện Vi sinh vật & Công nghệ Sinh học

Hà Nội, năm 2011

1

MỤC LỤC

PHẦN I. BÁO CÁO TÓM TẮT 3

Bằng tiếng Việt 3

Bằng tiếng Anh 8

PHẦN II. BÁO CÁO TỔNG KẾT 12

Giải thích chữ viết tắt 13

Danh sách những người tham gia thực hiện ñề tài 13

Danh mục các bảng và hình 14

MỞ ðẦU 15

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 16

1.1 Kháng sinh 16

1.1.1. Khái niệm chung 16

1.1.2. Lịch sử phát triển kháng sinh 16

1.1.3. Phân loại kháng sinh 18

1.1.4. Kháng sinh kháng khối u 21

1.1.5. Nhu cầu phát triển kháng sinh mới 21

1.2 Xạ khuẩn 22

1.2.1. Các ñặc ñiểm chung 22

1.2.2. Xạ khuẩn và các chất thứ sinh 23

1.3 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn ở Việt Nam 23

1.4 Nội dung và mục ñích của nghiên cứu 24

CHƯƠNG II - NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1. Nguyên vật liệu 25

2.1.1. ðối tượng nghiên cứu 25

2.1.2. Hóa chất 25

2.1.3. Thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu 25

2.2. Phương pháp nghiên cứu 25

2.2.1. Phương pháp phân lập xạ khuẩn 25

2.2.2. Các vi sinh vật kiểm ñịnh 26

2.2.3. Sàng lọc xạ khuẩn sinh kháng sinh 27

2.2.4. Chiết bằng ethyl-acetate 28

2.2.5. Sắc ký các chất chiết thu ñược 28

2.2.6. Sàng lọc chủng xạ khuẩn sinh anthracycline 29

2.2.7. Phép thử ñộc tế bào 30

2

2.2.8. Các phương pháp phân loại xạ khuẩn 30

CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

3.1. ða dạng sinh học các chủng xạ khuẩn thu thập ñược ở

Vườn Quốc gia Cát Bà 32

3.2. Sàng lọc xạ khuẩn sinh kháng sinh 33

3.3. Hiệu quả tách chiết dịch nuôi cấy các chủng xạ khuẩn chọn lọc ñược 35

3.4. Phân tích sắc ký dịch nuôi các chủng xạ khuẩn chiết trong ethyl acetate 36

3.4.1. Sắc ký bản mỏng (TLC) 36

3.4.2. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 38

3.5. ðặc ñiểm nhận dạng của các chủng xạ khuẩn chọn lọc ñược 42

3.5.1. ðặc ñiểm hình thái của các chủng thuộc Streptomyces 42

3.5.2. Giải trình tự rDNA 16S ñối với các chủng xạ khuẩn thuộc chi Nonomuraea 44

3.6. Sàng lọc khả năng sinh anthracyline của các chủng xạ khuẩn chọn lọc ñược 45

3.7. Các nghiên cứu liên quan ñến các chủng có hoạt tính ñộc tế bào 46

3.7.1. Hoạt tính gây ñộc tế bào 46

3.7.2. Phân tích HPLC dịch nuôi chiết trong ethyl acetate

của các chủng có hoạt tính ñộc tế bào 47

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

PHỤ LỤC 62

3

PHẦN I. BÁO CÁO TÓM TẮT

1. Tên ñề tài: ðiều tra, nghiên cứu một số hoạt chất có khả năng kháng vi sinh

vật và kháng dòng tế bào ung thư từ xạ khuẩn

2. Mã số: QG.09.48

3. Thời gian thực hiện: 2 năm (2009 - 2011)

4. Cấp quản lý: ðại học Quốc gia Hà nội

5. Chủ trì ñề tài: TS. Nguyễn Huỳnh Minh Quyên

Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học - ðHQGHN

ðiện thoại: 37547694; Fax: 37547407; Email: [email protected]

6. Cán bộ tham gia: - TS. Nguyễn Quỳnh Uyển

- TS. ðinh Thúy Hằng

- CN. Lê Phương Chung

- ThS. Phan Thị Hà

- CN. Lê Hồng Anh

7. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu

Nghiên cứu này nhằm tìm hiểu sự ña dạng sinh học và sàng lọc các chủng xạ

khuẩn có hoạt tính kháng vi sinh vật trong bộ sưu tập các chủng xạ khuẩn thu thập từ ñảo

Cát Bà, một vườn quốc gia có ña dạng sinh học cao ở Việt Nam. Các chất kháng sinh do

các chủng lựa chọn sinh ra ñược tiếp tục nghiên cứu nhằm tìm kiếm bản chất của chúng.

Cụ thể là:

- Phân lập xạ khuẩn từ mẫu ñất và lá mục ở ñảo Cát Bà, Hải Phòng qua ñó ñánh

giá mức ñộ ña dạng của ñối tượng

- Sàng lọc các chủng có hoạt tính kháng sinh cao

- Tách chiết sơ bộ thu các chất có hoạt tính kháng sinh từ các chủng chọn lọc ñược

- Nghiên cứu tính chất của các chất kháng sinh thu ñược bằng sắc ký bản mỏng

(TLC) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

- Phân loại, ñịnh danh các chủng xạ khuẩn (bằng mô tả hình thái hoặc bằng giải

trình tự gene 16S của rDNA) có hoạt tính kháng sinh cao.

4

- Thử nghiệm hoạt tính kháng các dòng tế bào ung thư người của chất chiết từ dịch

nuôi của một số chủng có tiềm năng

- Phân tích HPLC chất chiết từ dịch nuôi của các chủng có hoạt tính kháng tế bào

ung thư làm cơ sở cho nghiên cứu bản chất của các hợp chất ñó.

8. Các kết quả ñạt ñược

8.1. Kết quả về mặt khoa học

- 424 chủng xạ khuẩn (gồm 353 chủng từ mẫu ñất và 71 chủng từ mẫu lá cây mục) thu

thập tại vườn Quốc gia ñã ñược phân loại (bằng quan sát hình thái kết hợp với ñọc

trình tự gene rDNA 16S) cho thấy gần 70% thuộc chi Streptomyces, còn lại thuộc

nhóm xạ khuẩn hiếm. Các chi xạ khuẩn hiếm có tỷ lệ cao trong bộ sưu tập này là

Micromonospora (hơn 7% trong tổng số 424 chủng), Nonomuraea (4%) và Nocardia

(gần 3%).

- 424 chủng xạ khuẩn này ñã ñược sàng lọc hoạt tính kháng sinh với 4 vi sinh vật kiểm

ñịnh ñại diện cho 3 nhóm vi sinh vật lớn là vi khuẩn (Gram âm: Escherichia coli,

Gram dương: Micrococcus luteus), nấm men (Candida albicans) và nấm sợi

(Fusarium oxysporium).

- 115 chủng trong số 424 chủng nói trên ñã biểu hiện hoạt tính kháng ít nhất một trong

bốn vi sinh vật kiểm ñịnh.

- Với 115 chủng có hoạt tính này có 2 chủng (A1073, A1393) kháng cả 4 chủng vi sinh

vật kiểm ñịnh, 7 chủng (A232, A390, A1018, A1022, A1041, A1043 và A1470)

kháng với 3 chủng kiểm ñịnh, 8 chủng (A45, A149, A154, A160, A396, A410, A427

và A444) có hoạt tính kháng 2 vi sinh vật kiểm ñịnh. Xét về ñối tượng bị kháng thì 14

chủng có hoạt tính kìm hãm vi khuẩn Gram âm (E. coli), 14 chủng kìm hãm vi khuẩn

Gram dương (M. luteus); 11 chủng có hoạt tính kháng cả hai nhóm vi khuẩn; 12 chủng

có hoạt tính kháng nấm sợi (F. oxysporium) và chỉ 6 chủng có hoạt tính kháng nấm

men (C. albicans). Như vậy tổng cộng có 17 chủng có hoạt tính kháng ít nhất 2 vi sinh

vật kiểm ñịnh ñã ñược lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo. ðiều thú vị là 17 chủng

này chỉ thuộc 2 chi Streptomyces (10 chủng) và Nonomuraea (7 chủng).

- 17 chủng ñã ñược nuôi cấy thu dịch nuôi và dịch nuôi ñã ñược chiết bằng ethyl acetate

ñể thu các hợp chất có hoạt tính sinh học. Hiệu quả chiết chất tan trong ethyl acetate

(từ 1 lít dịch nuôi cấy) dao ñộng từ 30mg (chủng A154) ñến 2152mg (chủng A444).

5

So với chất khô thì chất chiết ñược chiếm từ 0,51% (chủng A154) ñến 14,89% (chủng

A396).

- Các chất tan trong ethyl acetate của dịch nuôi 17 chủng xạ khuẩn ñã ñược phân tích

sắc ký bản mỏng (TLC) ñể so sánh với ba kháng sinh là chloramphenicol, kitasamycin,

erythromycin và với dịch nuôi của chủng ñối chứng sinh anthracycline (A16). Số băng

thu ñược sau sắc ký dao ñộng từ 1 ñến 4 băng. Có 8 chủng (A149, A154, A160, A232,

A410, A427, A1073, A1393) chỉ cho 1 băng, 3 chủng (A396, A444, A1018) cho phổ

có 2 băng, 4 chủng (A45, A1041, A1043, A1470) cho phổ 3 băng và 2 chủng (A390,

A1022) cho phổ 4 băng. So với các kháng sinh chuẩn thì thấy chất chiết từ dịch nuôi

của chủng A396 là có băng tương ứng với chloramphenicol; chất chiết từ dịch nuôi

chủng A45 và A410 có băng trùng với băng của erythromycin, không có mẫu nào có

băng tương ñồng với các băng của kháng sinh kitasamycin. So với dịch nuôi của

chủng ñối chứng sinh anthracycline, các mẫu A1018 và A1022 có phổ sắc ký rất gần

với ñối chứng này.

- Các chất tan trong ethyl acetate của 17 chủng lựa chọn ñược ñược tiếp tục phân tích

qua sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với các ñiều kiện sắc ký như với các kháng

sinh chuẩn. Kết quả cho thấy ngoài chủng A396 có ñỉnh tương tự với ñỉnh thu ñược từ

chloramphenicol, tất cả các mẫu còn lại không tìm thấy mối tương quan nào so với các

kháng sinh ñối chứng.

- Một trong những nghiên cứu nữa ñược thực hiện với 17 chủng chọn lọc ñược là thực

hiện thử nghiệm biến ñổi màu phụ thuộc pH. ðây là phép thử ñặc hiệu ñối với các

chủng sinh kháng sinh thuộc nhóm anthracycline. Qua ñó nhận thấy có hai chủng có

biểu hiện dương tính với phép thử này là A1018 và A1073.

- Như vậy với các bước nghiên cứu liên quan, từ 17 chủng có hoạt tính kháng sinh

tương ñối cao, 3 chủng ñược lựa chọn thử nghiệm hoạt tính gây ñộc tế bào ung thư

người là A1018 (có phổ TLC và phản ứng ñổi màu pH tương tự chủng ñối chứng),

A1022 (có phổ TLC tương tự ñối chứng) và A1073 (phản ứng ñổi màu pH).

- Bằng thử nghiệm với ba dòng tế bào ung thư người là ung thư gan, phổi và cơ vân tim,

các hợp chất chiết từ dịch nuôi của cả ba chủng chọn lọc ñược của ñề tài ñều có tác

dụng dương tính với cả ba dòng tế bào ung thư. So sánh về chỉ số IC50 (nồng ñộ gây

chết 50% tế bào ung thư, tức chỉ số này càng nhỏ thì hiệu quả gây ñộc tế bào càng lớn)

thì thấy trong ba mẫu nghiên cứu chất chiết từ dịch chiết của chủng A1073 có chỉ số

này thấp nhất và thấp gần bằng ñối chứng dương (một trong những chất có khả năng

6

diệt tế bào) của phép thử; thấp bằng so với chủng ñối chứng sinh anthracycline và thấp

hơn ñáng kể so với hai chủng còn lại. ðây là một trong những kết quả nổi bật nhất của

ñề tài, làm tiền ñề cho các hướng nghiên cứu tiếp theo.

- Chất tan trong ethyl acetate của dịch nuôi 3 chủng có hoạt tính kháng tế bào ung thư

nói trên ñã ñược phân tích HPLC với cùng một ñiều kiện sắc ký với các ñối tượng

tương tự hiện ñang ñược thực hiện tại Phòng thí nghiệm Vi sinh vật học phân tử,

Trung tâm công nghệ sinh học quốc tế, ðại học Tổng hợp Osaka. Qua phân tích kết

quả sau sắc ký các chất chiết ñược từ dịch nuôi chủng A1018 cho 8 ñỉnh khác nhau, từ

chủng A1022 cho 5 ñỉnh khác nhau và chủng A1073 cho 6 ñỉnh khác nhau. Các dữ

liệu liên quan hiện ñang ñược so sánh phân tích với cơ sở dữ liệu hiện có tại cơ sở nói

trên nhằm tìm kiếm bản chất của các chất ñó. ðây là một kết quả thể hiện sự hợp tác

quốc tế của ñề tài.

8.2. Kết quả ñào tạo

ðề tài ñã góp phần ñào tạo 01 Thạc sỹ chuyên ngành công nghệ sinh học thuộc

chương trình ñào tạo liên kết quốc tế với ðại học Liege, Vương quốc Bỉ với tên ñề tài là:

“Biodiversity and antibiotic activity of actinomycetes isolated from Catba island,

Vietnam”. Học viên Nguyễn Phương Chung ñã bảo vệ thành công luận văn với kết quả

xuất sắc trước Hội ñồng ngày 24 tháng 2 năm 2011.

8.3. Bài báo

Kết quả của ñề tài ñã ñược ñúc kết thành 02 bài báo:

• Diversity and antibiotic activity of actinomycetes isolated from Catba island,

Vietnam. Tạp chí Công nghệ sinh học (ñã nhận ñăng).

• Bước ñầu nghiên cứu sàng lọc kháng sinh chống ung thư từ xạ khuẩn thu thập ở

vườn Quốc gia Cát Bà, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, ðại học Quốc gia Hà Nội

(ñã nhận ñăng).

9. Tình hình sử dụng kinh phí

- Tổng kinh phí của ñề tài ñược duyệt: 100.000.000 VNð

- Tổng kinh phí của ñề tài ñã quyết toán: 100.011.400 VNð, bao gồm các mục:

+ Chi phí thuê mướn: 40.000.000

+ Chi phí nghiệp vụ chuyên môn: 49.084.000

+ Photo tài liệu, văn phòng phẩm: 4.235.000