Hoàn thiện quy trình công nghệ chiết xuất hoạt chất từ cây Trinh nữ hoàng cung ( Crinum latufolium L. Amryllidaceace ) để sản xuất viên nang điều trị bệnh phì đại lành tính tuyến tiền liệt

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

CÔNG TY CP DƯỢC LIỆU TW2

BÁO CÁO TỔNG KẾT

DỰ ÁN SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM CẤP NHÀ NƯỚC

HOÀN THIỆN QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ CHIẾT XUẤT HOẠT

CHẤT TỪ CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG (Crinum latifolium L.

Amaryllidaceace) ĐỂ SẢN XUẤT VIÊN NANG ĐIỀU TRỊ BỆNH

PHÌ ĐẠI LÀNH TÍNH TUYẾN TIỀN LIỆT

MÃ SỐ: KC.10.DA17

Chủ nhiệm dự án: TS. NGUYỄN THỊ NGỌC TRÂM

6613

26/10/2007

TP.HCM, tháng 09 năm 2007

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

CÔNG TY CP DƯỢC LIỆU TW2

BÁO CÁO TỔNG KẾT

DỰ ÁN SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM CẤP NHÀ NƯỚC

HOÀN THIỆN QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ CHIẾT XUẤT HOẠT

CHẤT TỪ CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG (Crinum latifolium L.

Amaryllidaceace) ĐỂ SẢN XUẤT VIÊN NANG ĐIỀU TRỊ BỆNH

PHÌ ĐẠI LÀNH TÍNH TUYẾN TIỀN LIỆT

MÃ SỐ: KC.10.DA17

CHỦ NHIỆM DỰ ÁN: TS. NGUYỄN THỊ NGỌC TRÂM

CƠ QUAN CHỦ TRÌ: CÔNG TY CỔ PHẦN DƯỢC LIỆU TW2

CƠ QUAN CHỦ QUẢN: BỘ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ

THỜI GIAN: 1.2006 - 6.2007

TỔNG KINH PHÍ DỰ ÁN: 4.934,3 triệu đồng

KINH PHÍ TỪ NGÂN SÁCH: 1.300 triệu đồng

KINH PHÍ THU HỒI: 835 triệu đồng

TP.HCM, tháng 09 năm 2007

1

MỤC LỤC

PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ..................................................................................................... 7

PHẦN II: TỔNG QUAN.................................................................................................. 13

1. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về cây Trinh nữ hoàng cung

(Crinum latifolium L.)….............................................................................................. 13

2. Tính cấp thiết và khả thi của dự án.......................................................................... 17

3. Mục tiêu dự án.. ....................................................................................................... 17

4. Nội dung dự án......................................................................................................... 18

PHẦN III: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.. .................................. ..19

1. Nguyên liệu….......................................................................................................... 19

2. Phương pháp nghiên cứu… ..................................................................................... 19

PHẦN IV: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU…........................................................................... 22

1. Hoaøn thieän quy trình coâng ngheä chieát xuaát alcaloid töø döôïc lieäu laù Trinh

nöõ hoaøng cung (tươi vaø khoâ) duøng laøm nguyeân lieäu saûn xuaát vieân nang

Trinh nöõ hoaøng cung (Crila) ôû quy moâ công nghiệp............................................ 22

1.1. Nghiên cứu chiết xuất hoạt chất alcaloid trong lá cây Trinh nữ hoàng cung.. ..... 23

1.1.1. Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết alcaloid toàn phần từ dược liệu khô

TNHC........................................................................................................................... 23

1.1.2. Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết alcaloid toàn phần từ dược liệu tươi

TNHC........................................................................................................................... 25

1.2. Máy móc thiết bị và quy trình công nghệ chiết xuất.. .......................................... 27

1.3. Vệ sinh vô trùng và an toàn lao động.. ................................................................. 30

1.4. Nội dung kiểm tra trong quá trình sản xuất. ......................................................... 30

1.5. Xử lý dư phẩm của quá trình chiết xuất................................................................ 30

1.6. Hồ sơ làm việc cần thiết........................................................................................ 30

2. Hoaøn thieän quy trình saûn xuaát vieân nang töø baùn thaønh phaåm cuûa

Trinh nöõ hoaøng cung.. ........................................................................................... 31

2.1. Công thức viên nang Crila. ................................................................................... 31

2.2. Một số kết quả nghiên cứu về bào chế viên nang…............................................. 32

2.2.1. Độ ẩm tới hạn và độ ẩm cân bằng của hạt. ........................................................ 32

2.2.2. Dải phân bố cỡ hạt. ............................................................................................ 34

2.2.3. Tính chảy của hạt.. ............................................................................................. 34

2.2.4. Tính phân tán trong nước................................................................................... 35

2.3. Khảo sát viên nang Crila....................................................................................... 36

2

2.4. Nghiên cứu theo dõi độ ổn định của sản phẩm..................................................... 37

2.5. Quy trình sản xuất viên nang CRILA.. ................................................................. 39

2.5.1. Cách tiến hành.................................................................................................. ..39

2.5.2. Máy móc thiết bị chủ yếu................................................................................... 39

2.5.3. Quy trình công nghệ sản xuất viên nang Crila................................................... 40

2.5.4. Vệ sinh vô trùng và an toàn lao động.. .............................................................. 41

2.5.5. Nội dung kiểm tra trong quá trình sản xuất.. ..................................................... 41

2.5.6. Dư phẩm phế phẩm............................................................................................ 42

2.6. Hồ sơ làm việc cần thiết........................................................................................ 42

3. Nghiên cứu nâng cấp tiêu chuẩn kiểm nghiệm.. ................................................. 43

3.1. Nghiên cứu định tính và định lượng alcaloid crinamidin trong nguyên liệu,

bán thành phẩm và thành phẩm bằng phương pháp HPLC… ..................................... 43

3.2. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở lá TNHC, cao khô TNHC và viên nang Crila........... 52

PHẦN V: KẾT QUẢ VÀ ỨNG DỤNG CỦA DỰ ÁN.. ....................................................... 69

PHẦN VI: BÀN LUẬN.................................................................................................... 72

PHẦN VII: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.. ....................................................................... 73

PHẦN VIII: TÀI LIỆU THAM KHẢO.. ........................................................................... 75

PHẦN IX: CÁC PHỤ LỤC.. ............................................................................................ 79

3

KÝ HIỆU VÀ Ý NGHĨA CÁC CHỮ VIẾT TẮT

TNHC Trinh Nữ Hoàng Cung Crinum latifolium L.

HPLC: Sắc ký lỏng hiệu năng

cao High Performance Liquid Chromatography

SKLM: Sắc ký lớp mỏng Thin Layer Chromatography

S: Độ lệch chuẩn Standard Deviation

RSD: Độ lệch chuẩn tương đối Relative Standard Deviation

LOD: Giới hạn phát hiện Detection Limit

LOQ: Giới hạn định lượng Quantitation Limit

UV-VIS Tử ngoại – khả kiến Ultra Violet (Spectroscopy)

IR: Hồng ngoại Infrared Spectroscopy

NMR: Cộng hưởng từ hạt nhân Proton nuclear Magnetic Resonance

MS: Phổ khối lượng. Mass Spectroscopy

4

BẢN TỰ ĐÁNH GIÁ

VỀ TÌNH HÌNH THỰC HIỆN VÀ NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI

CỦA DỰ ÁN KH&CN CẤP NHÀ NƯỚC

1. Tên đề tài:

Hoàn thiện quy trình công nghệ chiết xuất hoạt chất từ cây TNHC (Crinum

latifolium L.) để sản xuất viên nang điều trị phì đại lành tính tuyến tiền liệt.

Mã số: KC.10.DA17

2. Thuộc chương trình Khoa Học Công Nghệ trọng điểm cấp Nhà nước giai đoạn

2001-2005. “Khoa học và công nghệ phục vụ chăm sóc và bảo vệ sức khỏe cộng

đồng”

3. Chủ nhiệm dự án: TS. NGUYỄN THỊ NGỌC TRÂM

4. Cơ quan chủ trì dự án: CÔNG TY CP DƯỢC LIỆU TW2

5. Thời gian thực hiện: 18 tháng (từ tháng 1 năm 2006 đến tháng 6 năm 2007)

6. Tổng kinh phí thực hiện dự án: 4.934,3 triệu đồng

Trong đó: kinh phí từ NSNN: 1.300 triệu đồng (bằng chữ: một ngàn ba trăm triệu

đồng)

Kinh phí thu hồi: 835 triệu đồng.

7. Tình hình thực hiện dự án so với hợp đồng.

7.1 .Về mức độ hoàn thành khối lượng công việc.

Hoàn thành 3 mục tiêu của dự án:

- Hoàn thiện quy trình công nghệ chiết xuất hoạt chất alcaloid từ dược liệu

TNHC ở quy mô công nghiệp.

- Hoàn thiện quy trình sản xuất viên nang từ bán thành phẩm của TNHC.

- Nâng cấp tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu, bán thành phẩm và thành

phẩm định lượng Crinamidin bằng phương pháp HPLC.

Hoàn thành 5 nội dung của dự án:

- Hoaøn thieän quy trình coâng ngheä chieát xuaát alcaloid töø döôïc lieäu laù TNHC

(laù TNHC töôi vaø laù TNHC khoâ) duøng laøm nguyeân lieäu saûn xuaát vieân nang

Trinh nöõ hoaøng cung (CRILA) ôû quy moâ công nghiệp.

- Hoaøn thieän quy trình saûn xuaát vieân nang töø baùn thaønh phaåm cuûa TNHC.

Nghiên cứu ổn định thuốc từ 24 tháng lên 36 tháng.

- Naâng caáp tieâu chuaån kieåm nghieäm nguyeân lieäu, baùn thaønh phaåm vaø thaønh

phaåm. Tạo chất chuẩn tinh khiết crinamidin – định lượng bằng phương pháp

HPLC.

- Xaây döïng tieâu chuaån cơ sở cuûa lá TNHC, cao khoâ TNHC, thuoác thaønh

phaåm vaø thaåm ñònh laïi thuoác ñaõ xaây döïng.

- Saûn xuaát 10.098.000 vieân thuoác Crila

5

7.2 .Về yêu cầu khoa học và chỉ tiêu cơ bản của các sản phẩm KHCN.

- Sản phẩm của dự án là Viên nang Trinh nữ hoàng cung (CRILA) là một viên

thuốc mới, đạt tiêu chuẩn cơ sở có tác dụng điều trị bệnh phì đại lành tính

tuyến tiền liệt, giá thành hợp lý, hiệu quả điều trị cao.

- Sản phẩm được chế tạo từ hai quy trình công nghệ về chiết xuất và bào chế

đã được hoàn thiện và nâng cấp.

- Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm viên thuốc mới bằng phương pháp HPLC.

Tạo chất chuẩn tinh khiết crinamidin.

7.3 .Về tiến độ thực hiện.

- Đảm bảo đúng tiến độ của đề cương và hợp đồng khoa học công nghệ số

11/2006/HĐ-DA, ngày 28/12/2006.

- Nghiệm thu cấp cơ sở đúng quy định của Bộ Khoa học Công nghệ.

8. Về những đóng góp mới của đề tài:

Dự án đã hoàn thiện quy trình công nghệ chiết xuất các hoạt chất có hoạt tính

sinh học có tác dụng ức chế sự phát triển của khối u. Sản phẩm của dự án là viên

nang CRILA được bào chế từ nguyên liệu chiết xuất từ dược thảo cây TNHC

(Crinum latifolium L.). Hiện nay, đã có hai viên thuốc là viên nang mềm

Tadenan được bào chế từ vỏ cây Mận Gai Châu Phi có tên khoa học là Pygeum

africanum và Permixon từ quả cây Serenoa repens của Pháp sản xuất, và viên

Crila là viên thuốc thứ ba sau hai viên thuốc trên được xếp vào kho tàng thuốc

điều trị tuyến tiền liệt. Viên CRILA còn có khả năng chữa trị bệnh u xơ tử cung

và cũng là viên thuốc đầu tiên chữa u xơ tử cung được sản xuất từ dược thảo.

Cho đến nay chưa có một viên thuốc nào chữa u xơ tử cung được sản xuất từ

nguồn gốc thiên nhiên. Viên CRILA ra đời sẽ cung cấp đủ thuốc phục vụ sức

khỏe người bệnh trong nước và xuất khẩu.

.Về giải pháp khoa học – công nghệ.

Đã hoàn thiện một quy trình công nghệ, tạo được nguyên liệu để sản xuất thuốc

điều trị các bệnh khối u từ dược thảo Việt Nam bằng những thiết bị máy móc

sản xuất trong nước và được thiết kế theo yêu cầu của quy trình công nghệ cần

tạo ra sản phẩm là các alcaloid có hoạt tính sinh học.

.Về phương pháp nghiên cứu.

Sử dụng các phương pháp nghiên cứu cổ điển và kết hợp với các phương pháp

nghiên cứu hiện đại để hoàn thành nội dung của dự án:

6

- Chiết xuất bằng phương pháp ngấm kiệt.

- Các phương pháp hóa lý: Phổ hồng ngoại, khối phổ, cộng hưởng từ hạt

nhân.

- Sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột.

- Định lượng Crinamidin bằng phương pháp HPLC.

.Những đóng góp mới khác.

Trong quá trình nghiên cứu hoàn thiện quy trình chiết xuất chúng tôi đã có cải

tiến dung môi chiết xuất nâng cao chất lượng sản phẩm so với giai đoạn nghiên

cứu ở phòng thí nghiệm. Khi sử dụng dung môi chiết cồn/acid, nước/acid, trước

đây chúng tôi sử dụng acid tartric nên sản phẩm thu được có mùi chua của acid

tartric kết tinh trong cao. Để giải quyết vấn đề này trong quá trình hoàn thiện

quy trình công nghệ chiết xuất chúng tôi đã thay acid tartric bằng acid acetic.

Sản phẩm thu được không còn mùi acid do acid acetic bốc hơi trong quá trình cô

loại dung môi.Sản phẩm thu được đạt chất lượng tốt.

Chúng tôi đã giải quyết được vấn đề giá thành sản phẩm hợp lý do hoàn thiện

quy trình chiết xuất nguyên liệu từ lá tươi, khâu xử lý nguyên liệu tươi đúng

theo quy trình kỹ thuật đã phá vỡ màng nguyên sinh của tế bào rồi chiết với

dung môi thích hợp.

Tiết kiệm chi phí điều trị bệnh so với sử dụng thuốc ngoại nhập để điều trị bệnh

phì đại lành tính tuyến tiền liệt.

Tạo công ăn việc làm cho người lao động. Tạo sản phẩm thuốc đi từ nguồn dược

liệu trong nước phục vụ sức khỏe cộng đồng.

7

PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ

Beänh phì ñaïi laønh tính tuyeán tieàn lieät laø moät caên beänh phoå bieán trong vaø

ngoaøi nöôùc. Thuoác ñieàu trò beänh phì ñaïi laønh tính tuyeán tieàn lieät laø gaùnh naëng ñoái

vôùi beänh nhaân vaø gia ñình hoï, do chi phí ñieàu trò cao. Theo keát quaû nghieân cöùu

hôn 30% nam giôùi ôû löùa tuoåi 40 trôû leân ñeàu maéc phaûi caên beänh naøy. Tình traïng

söùc khoûe ngöôøi beänh giaûm suùt do phaûi ñi tieåu nhieàu laàn trong ñeâm, aûnh höôûng ñeán

sinh hoaït vaø laøm vieäc. Do ñoù nhu caàu veà thuoác ñieàu trò beänh phì ñaïi laønh tính

tuyeán tieàn lieät ngaøy caøng trôû neân caáp thieát. Để đáp ứng nhu cầu về thuốc chữa

bệnh phì đại lành tính tuyến tiền liệt, Công ty Cổ phần Dược Liệu TW2 đã được Bộ

Y Tế cho phép thực hiện nghiên cứu hai đề tài sau:

Đề tài 1: Nghiên cứu hoàn thiện quy trình công nghệ chiết xuất alcaloid toàn

phần từ lá cây Trinh Nữ Hoàng Cung (Crinum latifolium L.) dùng làm nguyên

liệu sản xuất thuốc điều trị bệnh u xơ tuyến tiền liệt, u xơ tử cung. Do

TS.Nguyễn Thị Ngọc Trâm làm chủ nhiệm đề tài. Kết quả nghiệm thu đạt loại khá

với các nội dung đã nghiên cứu sau:

1. Nghiên cứu trồng cây Trinh nữ hoàng cung làm nguyên liệu cho nghiên cứu

và sản xuất.

- Chọn được giống cây Trinh nữ hoàng cung đúng về mặt hình thái thực vật và

có hiệu suất trồng cao.

- Xác định được kỹ thuật trồng.

- Sơ bộ đánh giá được ảnh hưởng của các yếu tố khí hậu, thổ nhưỡng lên năng

suất thu hoạch.

- Xác định được thời điểm thu hoạch lá cho năng suất cao.

2. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho dược liệu lá Trinh Nữ Hoàng Cung.

- Đã xây dựng được tiêu chuẩn cơ sở hoàn chỉnh cho nguyên liệu Trinh Nữ

Hoàng Cung.

- Kiểm nghiệm nguyên liệu thu hoạch theo tiêu chuẩn cơ sở đã xây dựng.

3. Nghiên cứu sơ bộ thực vật, hóa học và chiết xuất.

- Đã nghiên cứu, khảo sát về mặt hình thái thực vật, vi phẫu và soi bột lá Trinh

Nữ Hoàng Cung để xác định tính xác thực khi xây dựng tiêu chuẩn và kiểm

nghiệm nguyên liệu.

- Xây dựng các phương pháp định tính, định lượng alcaloid toàn phần tính

theo lycorine để phục vụ nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn, nghiên cứu chiết

xuất và làm cơ sở để đánh giá hiệu suất quy trình chiết suất.

- Chiết thăm dò dược liệu bằng các dung môi khác nhau: dung môi có tính

phân cực yếu cloroform; dung môi không phân cực ether dầu hỏa; dung môi

phân cực mạnh cồn/acid, nước acid, chiết xuất với các độ cồn 96o

, 70o

, 50o

,

thử tác dụng sinh học của dịch chiết từ đó chọn được phương pháp chiết xuất

8

và dung môi thích hợp cho nghiên cứu quy trình chiết: Phương pháp chiết

xuất ngấm kiệt, cồn 70o

+ 2% acid tartric, tỉ lệ dung môi dược liệu 9:1

- Xây dựng được quy trình chiết tối ưu cho hiệu suất xấp xỉ 100% tính theo

alcaloid toàn phần.

4. Nghiên cứu hoàn thiện quy trình chiết.

- Đã tiến hành chiết thử ở quy mô pilot: 5kg/mẻ để hoàn thiện quy trình đã xây

dựng. Kết quả cho thấy quy trình khá ổn định, hiệu suất quy trình tính trên

lượng alcaloid toàn phần có trong cao khô đạt trung bình: 73,12 ± 7,78%.

- Tiêu chuẩn hóa được sản phẩm cao khô.

5. Khảo sát thăm dò dạng chế phẩm viên nang cứng.

- Đã khảo sát thử công thức và quy trình sản xuất viên nang TNHC (Crila) từ

cao khô TNHC là sản phẩm của quy trình chiết xuất với liều lượng 1 viên

nang tương đương 1g dược liệu khô.

6. Dự kiến quy trình và thiết bị chiết xuất TNHC.

- Trên cơ sở quy trình chiết xuất đã xây dựng được, chúng tôi đã dự kiến một

quy trình và dây chuyền thiết bị thích hợp cho triển khai sản xuất ở quy mô

lớn làm cơ sở cho việc chuẩn bị đầu tư sản xuất.

9

Sô ñoà 1: Sơ đồ tóm tắt quy trình coâng ngheä chieát xuaát alcaloid

từ lá khô TNHC ở quy mô pilot.

Boät laù TNHC

Baõ

Cắn

Cắn

Cao lỏng 1:1

Dịch lọc

Dịch lọc

Dịch chiết

Cồn + 2% acid tartric

Ngâm

Ngấm kiệt

Để lắng

Cô cách thuỷ

Để lắng

Cô cách thuỷ

Làm ẩm, ủ chiết