Giáo trình CÔNG NGHỆ DNA TÁI TỔ HỢP - Chương 3 doc

49

Chương 3

Kh in vitro

chuỗi polymerase (PCR)

PCR (polymerase chain reaction) là một kỹ thuật được sử dụng phổ

biến trong công nghệ sinh học hiện đại và đã đóng góp rất lớn cho những

tiến bộ về sinh học phân tử, đánh dấu một bư

(xem chương 1) và

kỹ thuật Southern blot (xem chương 5).

kéo dài

in vitro hiệu trong thiết bị điều nhiệt tuần

hoàn (thermocycler) còn gọi là máy PCR (Hình 3.1)

-

đ dạng

hiệu 20 nucleotide.

Hình 3.1. Thiết bị điều nhiệt tuần hoàn

I. Nguyên tắc của PCR

Taq polymerase (xem chương 1) là một loại enzyme DNA polymerase

chịu nhiệt (có ở vi khuẩn chịu nhiệt độ cao Thermus aquaticus

50

3’-

5’-3

).

Nguyên tắc của PCR được trình bày trong hình 3.2 và 3.3. T

DNA polymerase (gọi tắt là Taq pol) bắt đ

tổng hợp (synthetic oligonucleotide) có khoảng 10-20 nucleotide hoặc hơn.

Nếu biết trình tự của đoạn gen cần khuếch đại thì có thể tổng hợp nhân tạo

các primer tương ứng đ

- , qua đó từ 10-6

g DNA ban

đầu có thể khuếch đại (amplification) lên tới trên 1 g

:

- Gây biến tính (denaturation) ở 90-95oC

Trong giai đoạn biến tính, phân tử DNA khuôn mẫu ở dạng xoắn kép

được tách thành hai sợi đơn (single strands). Tất cả các phản ứng enzyme

trong giai đoạn này đều bị dừng lại (ví dụ: phản ứng tổng hợp DNA từ chu

kỳ trước đó).

- Gắn mồi (annealing) ở 40-65oC

Trong giai đoạn này các primer gắn vào các vị trí có trình tự tương

đồng ở DNA khuôn mẫu. Các primer bị lắc nhẹ chung quanh do chuyển

động Brown vì thế các liên kết ion được tạo thành và bị đứt gãy liên tục giữa

primer sợi đơn và DNA khuôn mẫu sợi đơn. Các liên kết ion ổn định hơ

đoạn nhỏ (các primer đ ) và trên các đ

đôi đó (khuôn mẫu và primer) Taq pol có thể bắt đầu quá trình

sao chép khuôn mẫu. Ở giai đoạn này phạm vi nhiệt độ được sử dụng có thể

rất rộng tùy thuộc vào trình tự nucleotide của primer, thông thường khoảng

55

oC, nhưng có khi chỉ 35oC hoặc đôi lúc lên đến 68oC.

- Kéo dài phân tử (extension) ở 70-72oC.