Giáo trình CƠ SƠ VÀ PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ - Chương 9 ppsx

Chương 9

PHÂN LẬP GENE TÁCH DÒNG PHÂN TỬ

VÀ BIỂU HIỆN GENE

Tóm tắt: Công nghệ ADN tái tổ hợp bao gồm các kĩ thuật tách dòng gene và

biểu hiện gene. Bắt đầu từ sự phân lập gene và sau đó là tạo vector tái tổ hợp,

biến nạp vào tế bào chủ, tách dòng và xác định trình tự gene. Protein là sản

phẩm biểu hiện gene. Quá trình biểu hiện gene ngoại lai bắt đầu từ việc đưa

gene vào vector biểu hiện và biến nạp vào tế bào chủ. Vector biểu hiện gene

được thiết kế bao gồm promotor mạnh và điều khiển được. E. coli là vi khuẩn

được sử dụng rộng rãi trong công nghệ ADN tái tổ hợp và sự biểu hiện gene

thành công nhất hiện nay vẫn là ở E. coli. Phân lập, tách dòng và biểu hiện

gene được minh hoạ bằng ví dụ về sự phân lập, xác định trình tự gene mã hoá

cho trichobakin-RIP và quá trình biểu hiện gene này.

Nội dung của chương gồm 3 vấn đề chính là: (1).Phân lập gene; (2). Tách

dòng gene; (3). Biểu hiện gene.

§1. PHÂN LẬP GENE

Phân lập gene hay phân lập đoạn ADN theo mục đích có thể được tiến

hành theo phương pháp sử dụng enzyme cắt hạn chế hoặc bằng phản ứng chuỗi

PCR. Phân lập gene mang ý nghĩa trong kĩ thuật giải trình tự ADN hay tạo dòng

ADN tái tổ hợp trong kĩ thuật chuyển gene.

1.1. Phân lập gene bằng kĩ thuật cắt hạn chế

Enzyme giới hạn (restrition enzyme) có khả năng cắt ADN ở những điểm

đặc hiệu. Với đặc tính đó người ta đã vận dụng để xác định những đoạn ADN

mã hoá cho các tính trạng của sinh vật và phân lập đoạn ADN đó. Kĩ thuật phân

lập gene nhờ enzyme giới hạn có thể gồm các bước sau:

(1). Tách chiết và tinh sạch ADN.

(2). Cắt ADN bởi enzyme giới hạn.

(3). Điện di trên gel agarose.

(4). Dựa vào ADN marker xác định được đoạn ADN cần phân lập.

(5). Biến tính ADN thành 2 mạch đơn ngay trên gel, rồi chuyển lên màng

126

lai phân tử. Vị trí các đoạn ADN được giữ nguyên.

(6). ADN cố định trên màng được lai với mẫu dò có đánh dấu phóng xạ

Rửa để loại bỏ các mẫu dò không bắt cặp.

(7). Dùng kĩ thuật phóng xạ tự ghi để định vị các phân tử lai ADN- mẫu

dò.

1.2. Phân lập gene bằng kĩ thuật PCR

Phản ứng chuỗi polimerase được tiến hành với các primers có trình tự biết

trước. Cặp primer gồm primer xuôi (sens primer) và ngược (antisens primer)

được thiết kế theo trình tự gene từ ngân hàng gene. Cặp mồi chuyên biệt này

được bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự ADN. Sử dụng cặp mồi

chuyên biệt cùng với ADN mẫu, enzyme, dNTP, Mg++, bufpher... trong thiết bị

nhân ADN (máy PCR) thì đoạn gene từ phân tử ADN mẫu sẽ được khuếch đại.

Phân lập gene bằng PCR có thể được tiến hành theo các bước sau:

(1) Tách chiết và tinh sạch ADN.

(2). Thiết kế primers.

(3). Chọn điều kiện phản ứng PCR.

(4). Nhân đoạn ADN trong máy PCR để phân lập đoạn gene theo mục

đích.

§2. TÁCH DÒNG GENE

2.1. Mục đích

- Tạo ra một lượng lớn bản sao một trình tự ADN xác định.

- Chọn lọc một thư viện gene.

2.2. Các bước của kĩ thuật tách dòng

- Chọn và xử lí vector.

- Xử lí ADN cần tạo dòng.

- Tạo vector tái tổ hợp.

- Chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào chủ.

- Phát hiện dòng cần tìm trong thư viện gene.

127