Fish word Vi sinh vật môi trường

A./ GIỚI THIỆU VỀ KĨ THUẬT FISH.

FISH là một kỹ thuật cho phép hiển thị, nhận dạng, liệt kê và định vị các tế

bào vi khuẩn. FISH không chỉ cho phép nhận ra các vi sinh vật quen thuộc, đã biết

môi trường nuôi cấy đặc hiệu mà còn xác định được các vi sinh vật lạ, chưa biết rõ

về điều kiện và môi trường nuôi cấy, do đó FISH có thể giúp chúng ta biết rõ về hệ

thống phức tạp của các quần thể vi sinh vật. FISH kết hợp sự chính xác của các kỹ

thuật di truyền phân tử và sự quan sát trực quan từ kính hiển vi, cho phép hình

dung và nhận biết các tế bào vi khuẩn trong môi trường tự nhiên hay trong các mô

bệnh. Độ nhạy và tốc độ thực hiện là những đặc điểm nổi bật đã giúp FISH trở

thành công cụng hiến cứu hữu hiệu nhất.

Trên thế giới, FISH được sử dụng trong việc mô tả quần thể vi sinh vật trong môi

trường tự nhiên, nổi bật là hệ vi sinh vật ở trầm tích biển Wadden, tại vịnh hẹp ở

Na-uy, sinh vật phù du ở sông hoặc biển, tuyết hồ trên núi cao, trong đất và trên bề

mặt rễ thực vật. FISH đặc biệt phổ biến trong y học, ngoài mục đích xác định các

mầm bệnh có nguồn gốc từ vi khuẩn (các bệnh về đường hô hấp, tiêu hóa, các bệnh

lây qua đường máu, ung thư…) FISH còn được sử dụng để chẩn đoán thường qui

sự bất thường về cấu trúc và số lượng nhiễm sắc thể (trước sinh và sau sinh) của

thai nhi.

Ở Việt Nam những nghiên cứu sử dụng FISH còn hạn chế, chủ yếu là ứng dụng

trong chẩn đoán các bệnh về di truyền. Do đó việc đẩy mạnh phát triển kỹ thuật

này ở nước ta trong tương lai sẽ mở ra một bước tiến mới trong việc nghiên cứu và

chẩn đoán vi sinh vật so với phương pháp nuôi cấy cổ điển.

B. PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN FISH

I. QUY TRÌNH THỰC HIỆN.

1.1. Tóm tắt qui trình thí nghiệm FISH

FISH dò tìm và phát hiện ra các trình tự acid nucleic của các loài vi sinh vật

mong muốn bằng cách dùng đầu dò được đánh dấu huỳnh quang lai đặc hiệu với

các trình tự đích đặc hiệu bổ sung với nó bên trong tế bào nguyên vẹn (không cần

phá vỡ tế bào).

Quy trình thực hiện bao gồm các bước cơ bản sau:

- Chuẩn bị mẫu và đầu dò.

- Cố định mẫu.

- Lai giữa đầu dò và trình tự đích đặc hiệu nằm trong tế bào.

- Rửa mẫu để loại bỏ các đầu dò không được lai.

- Dò tìm mẫu (bước này có thể bỏ qua nếu sử dụng đầu dò phát huỳnh quang

trực tiếp).

- Quan sát, hiển thị và lưu trữ kết quả.

Hình 1: Các bước chính của phương pháp FISH

1.2. Lựa chọn đầu dò đánh dấu huỳnh quang

Lựa chọn đầu dò: Như đã được đề cập từ trước, các trình tự đích được sử dụng

phổ biến trong FISH là các rRNA 16S vì chúng ổn định về mặt di truyền, số lượng

bản sao nhiều và cấu trúc được bán bảo tồn. Các đầu dò oligonucleotide ứng với

mỗi cấp độ phân loại, giữa các loài vi khuẩn nhân thật hay khuẩn cổ, cho đến các

chi và loài cụ thể đều có thể thiết kế được dựa theo kích thước của rRNA đích

Với sự tăng lên nhanh chóng của các đoạn thông tin di truyền trong các cơ

sở dữ liệu chung và thương mại, đoạn gen rRNA 16S giúp cho việc nhận

biết và định danh các loài vi sinh vật trở nên dễ dàng và chính xác. Điều này đặc

biệt có ý nghĩa khi tiến hành phân lập hỗn hợp vi khuẩn tạp hay các sinh vật chưa

từng nuôi cấy đặc hiệu. Số lượng lớn các bản sao rRNA 16S trong mỗi lần sao

chép và trong các quá trình hoạt động trao đổi chất của tế bào luôn cung cấp đủ số

lượng các trình tự đích để hiển thị được các dòng tế bào cụ thể, ngay cả các

oligonucleotide chỉ gắn một nhãn huỳnh quang trong thí nghiệm FISH. Việc lựa

chọn vị trí trình tự đích và quá trình thiết kế đầu dò phải được tiến hành với sự thận

trọng cao nhất. Gần đây, các trình tự đích khác như rRNA 23S, rRNA 18S mà gần

đây là mRNA cũng đã được xác định thành công bởi thí nghiệm FISH.

Việc lựa chọn đầu dò để sử dụng trong FISH phải xem xét đến tính đặc hiệu, độ

nhạy và khả năng xâm nhập vào tế bào. Một đầu dò oligonucleotide điển hình

thì có chiều dài khoảng 15 đến 30 bp, được tạo ra bằng một thiết bị tổng hợp tự

động. Các đầu dò ngắn thì dễ dàng tiếp cận được với trình tự đích, nhưng chúng lại

mang được ít các trình tự đánh dấu. Trong FISH, các trình tự đích thông dụng nhất

là rRNA 16S bởi vì chúng ổn định về mặt di truyền, cấu trúc được bán bảo tồn, và