Đánh giá một số dòng Lúa chọn lọc thế hệ R3, R4 có nguồn gốc từ Mô sẹo chịu mất nước

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

--------------------------------

VÕ VĂN NGỌC

ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ DÕNG LÖA CHỌN

LỌC THẾ HỆ R3, R4 CÓ NGUỒN GỐC TỪ

MÔ SẸO CHỊU MẤT NƢỚC

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2009

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

1

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

-------------------------------------

VÕ VĂN NGỌC

ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ DÕNG LÖA CHỌN

LỌC THỂ HỆ R3, R4 CÓ NGUỒN GỐC TỪ

MÔ SẸO CHỊU MẤT NƢỚC

Chuyên ngành : Di truyền học

Mã số: 60.42.70

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Thị Tâm

Thái Nguyên – 2009

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

2

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết

quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chƣa đƣợc ai công bố.

Tác giả

Võ Văn Ngọc

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

3

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Thị Tâm đã tận tình

hƣớng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên

cứu này.

Tôi xin cảm ơn KTV. Đào Thu Thủy (phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào),

CN. Nguyễn Ích Chiến, Ths. Phạm Thị Thanh Nhàn (phòng thí nghiệm Di truyền

học và Công nghệ gen, Khoa Sinh-KTNN, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Thái Nguyên)

đã giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo Trƣờng Đại học Sƣ phạm - Đại học

Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm và các thầy cô giáo, cán bộ khoa Sinh - KTNN, Ban

giám hiệu trƣờng THPT Thạch Thành 2 - Tỉnh Thanh Hoá đã tạo điều kiện giúp đỡ

tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn.

Tôi xin cảm ơn sự động viên, khích lệ của gia đình, bạn bè và đồng nghiệp

trong suốt thời gian làm luận văn.

Tác giả luận văn

Võ Văn Ngọc

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

4

MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU.................................................................................................................... 9

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................... 11

1.1. Giới thiệu về cây lúa ......................................................................................... 11

1.1.1. Nguồn gốc và phân loại.................................................................................... 11

1.1.2. Đặc điểm nông sinh học của cây lúa................................................................ 11

1.1.3. Giá trị kinh tế………………………………………………………………… 12

1.1.4. Tình hình sản xuất lúa trên thế giới và ở Việt Nam………………………….. 13

1.2. Hạn và cơ chế chịu hạn..................................................................................... 13

1.2.1. Khái niệm về hạn…………………………………………………………….. 13

1.2.2. Tác hại của hạn đối với cây lúa………………………………………………. 14

1.2.3. Cơ sở sinh lý, sinh hoá và phân tử của tính chịu hạn ở cây lúa……………… 14

1.3. Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật trong chọn dòng tế bào..... 19

1.3.1. Cơ sở khoa học của chọn dòng tế bào thực vật………………………………. 19

1.3.2. Hệ thống nuôi cấy sử dụng trong chọn dòng tế bào soma…………………… 19

1.3.3. Các phƣơng pháp chọn dòng tế bào………………………………………….. 20

1.3.4. Thành tựu nuôi cấy mô tế bào chọn dòng chống chịu ngoại cảnh bất lợi……. 21

1.3.5. Đánh giá các chỉ tiêu sinh lý, hóa sinh và sinh học phân tử các dòng đƣợc

hình thành qua nuôi cấy mô tế bào………………………………………………….

22

1.4. Một số nghiên cứu về gen ức chế sinh tổng hợp giberellin ở cây lúa ……... 23

Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP........................................................... 26

2.1. Vật liệu, thiết bị, hóa chất và địa điểm nghiên cứu ....................................... 26

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................ 27

2.2.1. Phƣơng pháp trồng và theo dõi ngoài đồng ruộng……………………........... 28

2.2.2. Phƣơng pháp hóa sinh……………………………………………………….. 28

2.2.3. Phƣơng pháp nuôi cấy in vitro ………………………………………............. 30

2.2.4. Đánh giá nhanh khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây mạ ……………………... 32

2.2.4. Phƣơng pháp sinh học phân tử……………………………………………….. 33

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

5

2.2.5. Phƣơng pháp xử lý kết quả và tính toán số liệu ............................................. 37

Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN…………………………………………. 38

3.1. Đặc điểm nông học các dòng lúa chọn lọc ở thế hệ R3, R4 và giống gốc có

nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nƣớc...............................................................

39

3.2. Phân tích hóa sinh các dòng chọn lọc............................................................... 45

3.2.1. Hàm lƣợng protein, lipit và đƣờng tan trong hạt các dòng chọn lọc ……….. 45

3.2.2. Đánh giá phổ điện di protein dự trữ hạt …………………………………….. 46

3.2.3. Hàm lƣợng axit amin liên kết trong hạt……………………………………… 47

3.3. Đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng chọn lọc ở thế hệ R4.................. 51

3.4. Phân lập và giải trình tự gen GA2ox1 ức chế sinh tổng hợp gibberellin...... 60

3.4.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số của dòng chọn lọc R4.05………………….. 60

3.4.2. Nhân gen GA2ox1 bằng kỹ thuật PCR………………………………………. 61

3.4.3. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến và chọn dòng plasmit tái tổ

hợp mang gen GA2ox1……………………………………………………………..

62

3.4.4. Tách chiết plasmit tái tổ hợp…………………………………………………. 63

3.4.5. Kết quả đọc trình tự nucleotit đoạn gen GA2ox1……………………………. 66

3.4.6. So sánh trình tự nucleotit của gen GA2ox1 giữa dòng R4.05 với các giống

đã công bố…………………………………………………………………………...

66

3.4.7. So sánh trình tự axit amin giữa dòng R4.05 với các giống đã công bố..……. 68

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ……………………………………………………... 72

CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN………………… 74

TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………………….. 75

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

6

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1. Hạt các dòng chọn lọc thế hệ R2 và giống gốc ……………………. 26

Bảng 3.1. Đặc điểm nông học và mức độ biến dị của các dòng lúa thế hệ R3.... 43

Bảng 3.2. Đặc điểm nông học dòng R4.04, R4.05 và giống KD………............. 44

Bảng 3.3. Hàm lƣợng protein, lipit và đƣờng tan trong hạt của các dòng chọn

lọc và giống gốc…………………………………………………...

45

Bảng 3.4. Hàm lƣợng các axit amin liên kết trong hạt của một số dòng chọn

lọc thế hệ R4 và giống gốc…………………………………………

48

Bảng 3.5. Hàm lƣợng các axit amin liên kết trong protein hạt của các dòng

chọn lọc thế hệ R4 và giống gốc……………………...……………

49

Bảng 3.6. Thăm dò khả năng tạo mô sẹ o và tái sinh cây củ a các dòng chọn lọc

và giống gốc……………………………………………………….

52

Bảng 3.7. Tỷ lệ thiệt hại ở giai đoạn cây mạ trong điều kiện gây hạn nhân tạo.. 56

Bảng 3.8. Chỉ số chịu hạn của các dòng chọn lọc thế hệ R4.............................. 58

Bảng 3.9. Thống kê các nucleotit sai khác giữa dòng R4.05 với các giống đã

công bố trên Genbank……………………………………………...

66

Bảng 3.10. So sánh mức độ tƣơng đồng gen GA2ox1 của dòng R4.05 với các

giống đã công bố trên Genbank……………………………………

67

Bảng 3.11. So sánh sự sai khác về axit amin ở một số vị tri giữa dòng R4.05

với các giống đã công bố trên Genbank………………………..…..

69

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

7

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát..................................................................... 27

Hình 3.1. Các dòng chọn lọc và giống gốc thế hệ R3 (vụ mùa 2008)…………… 38

Hình 3.2. Các dòng R3.04, R3.05 và Khang dân gốc (vụ mùa 2008)……………. 39

Hình 3.3. Hình ảnh điện di protein dự trữ trong hạt dòng chọn lọc và giống gốc. 47

Hình 3.4. Biểu đồ so sánh hàm lƣợng 7 loại axit amin không thay thế trong hạt

các dòng chọn lọc, giống gốc và của FAO………….............................

50

Hình 3.5. Khả năng tạo mô sẹo và tái sinh cây của các dòng chọn lọc và giống

gốc…………………………………………………………………….

52

Hình 3.6. Tốc độ mất nƣớc của mô sẹo các dòng chọn lọc và giống gốc sau xử

lý thổi khô……………………………………………………………

53

Hình 3.7. Khả năng sống sót củ a mô sẹo sau khi xử lý thổi khô………………… 54

Hình 3.8. Khả năng tái sinh cây từ mô sẹ o sau khi xử lý thổi khô……………….. 55

Hình 3.9. Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ thiệt hại do hạn gây ra sau 3, 5, 7 ngày hạn….. 57

Hình 3.10. Đồ thị biểu diễn khả năng chịu hạn của các dòng chọn lọc thế hệ R4.. 59

Hình 3.11. Kết quả điện di kiểm tra ADN tổng số của dòng R4.05……………… 61

Hình 3.12. Kết quả PCR nhân gen GA2ox1 với cặp mồi EX2-3-F và EX2-3-R… 62

Hình 3.13. Sơ đồ vector pBT đƣợc cải biến từ vector pUC18…………………… 62

Hình 3.14. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp và tế bào khả biến E.coli

DH5α.....

63

Hình 3.15. Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR………………………………. 64

Hình 3.16. Kết quả điện di plasmit tinh sạch chứa đoạn gen GA2ox1…………... 65

Hình 3.17. Điện di sản phẩm cắt plasmit tái tổ hợp bằng enzym BamHI………... 65

Hình 3.18. Trình tự nucleotit đoạn gen GA2ox1 tách dòng đƣợc của dòng R3.05

so với các giống đã công bố trên Genbank…………………………..

68

Hình 3.20. Trình tự nucleotit đoạn gen GA2ox1 và trình tự axit amin tƣơng ứng

của dòng R4.05 so với các giống đã công bố trên Genbank………….

70