công nghệ enzyme - protein - Chương 2

Chương 2

Phương pháp nghiên cứu enzyme

Có hai loại phương pháp dùng để nghiên cứu các phản ứng

enzyme. Một trong hai phương pháp đó là lựa chọn các mẫu sau những

thời gian nhất định và đo sự biến đổi của phản ứng enzyme. Qua hàng loạt

điểm riêng biệt nhận được sẽ xây dựng được đường biểu diễn của các

bước phản ứng. Phương pháp khác là tiến hành quan sát bản thân hỗn hợp

phản ứng theo tiến trình xảy ra và có thể xây dựng được một số lớn

những thay đổi, hoặc dựa vào các phương pháp tự động để ghi lại.

Chúng ta sẽ nhận được những đường biểu diễn liên tục các bước phát

triển của phản ứng enzyme.

Ở phương pháp đầu, người ta thường đo nồng độ cơ chất hoặc

nồng độ sản phẩm của phản ứng. Nếu phản ứng tăng thi cả hai cách vừa

nêu ở trên có thể được sử dụng để đo hoạt động của enzyme.

Trong mỗi trường hợp xác định tốc độ, người ta phải nhận được ít

nhất là 3 điểm: một điểm ở thời điểm không, điểm thứ hai ở khoảng thời

gian nhất định đã trôi qua, điểm thứ 3 ở khoảng thời gian lớn gấp hai lần

khoảng trước. Từ đó có thể kiểm tra được sự đúng đắn của phản ứng

enzyme trong khoảng thời gian quan sát.

Nói chung, phần lớn các phương pháp được sử dụng để nghiên cứu

các phản ứng enzyme là loại phương pháp nghiên cứu liên tục vì nó được

mọi người ưa dùng hơn.

2.1. Những nguyên tắc chung khi nghiên cứu enzyme

Như phần đầu đã nói đến, enzyme là những chất xúc tác sinh học

có bản chất protein và rất không ổn định. Trong những điều kiện bất lợi,

chúng rất không bền, có thể dễ dàng bị biến tính (denaturation) và bị mất

hoạt độ. Do đó, khi làm việc với enzyme, phải luôn luôn chú ý tránh

những điều kiện dễ làm mất hoạt độ của nó. Thông thường phần lớn các

enzyme hoạt động được ở vùng pH trung tính hoặc gần như trung

tính (pH = 7 ± 2). Vì vậy các yếu tố acid mạnh, kiềm mạnh dễ gây

biến tính enzyme.

Những ion kim loại nặng như chì, đồng, thủy ngân... và các điều

kiện về nhiệt độ cao cũng thường làm mất hoạt độ enzyme. Đặc biệt là khi

tách và làm sạch enzyme, cần tiến hành ở nhiệt độ thấp. Nhiệt độ thường

19

dùng cho các công việc này thông thường từ 0

0C đến 5

0C. Đối với các

enzyme không bền, các công đoạn làm sạch có thể được tiến hành ở nhiệt

độ thấp hơn (từ - 5

0C đến - 200C). Trong các trường hợp này, người ta hay

sử dụng các hỗn hợp lạnh như nước đá với CO2 hoặc nước đá với muối

NaCl, hoặc thậm chí người ta dùng cả hỗn hợp nước đá với sulfuric acid

đậm đặc... Ví dụ về một số hỗn hợp làm lạnh đã được trình bày trên bảng 2.1.

Bảng 2.1. Hỗn hợp làm lạnh

Thành phần hỗn hợp Tỷ lệ Nhiệt độ đạt được

Nước đá: muối 100:33 (3:1) - 21,30C

Nước đá: H2SO4 đậm đặc 100: 25 (4:1) - 20,00C

Như trên đã nói, nhiều enzyme bị mất hoạt tính ở các dung dịch có

pH < 5 hoặc pH > 9, tuy rằng có một số ngoại lệ như pepsin bền trong

acid. Do đó, tùy thuộc mỗi loại enzyme, song nên chú ý tránh pH quá acid

hoặc quá kiềm. Khi điều chỉnh pH của dung dịch đệm có chứa enzyme cần

phải thêm từ từ và rất thận trọng các acid hoặc kiềm. Và khi thêm hóa chất

để điều chỉnh pH thì nên tiến hành ở 0

0C. Khi làm việc với enzyme cũng

cần chú ý tránh tạo bọt vì nhiều enzyme bị biến tính (mất hoạt tính) ở mặt

phân cách hai pha nước và khí. Để tránh việc tạo bọt có thể xảy ra, người

ta thường rót dung dịch enzyme theo thành ống thủy tinh và không được

lắc. Có khi việc tách từng phần enzyme bằng bột dễ làm mất hoạt tính

enzyme. Vì vậy, để khắc phục tình trạng này, người ta thường thêm

ammonium sulfate dưới dạng dung dịch bão hòa của nó.

Trong khi xử lý các mẫu thí nghiệm như cắt, thái, xay nhỏ các

mẫu thực vật và động vật (ví dụ lá cây, thịt, các cơ quan nội tạng...) không

dùng các dụng cụ dao kéo dụng cụ xay đã han rỉ để tránh tác dụng của các

ion kim loại nặng như (Cu, Pb, Fe...) mà dùng dụng cụ inox..

Khi dùng các dung môi hữu cơ như aceton, alcol để kết tủa

enzyme cần tiến hành ở nhiệt độ thấp. Tách kết tủa enzyme bằng cách ly

tâm lạnh tốt hơn lọc lạnh vì tiến hành nhanh hơn. Ở một số trường hợp,

khi tách và làm sạch enzyme có hiện tượng giảm dần hoạt độ, vì vậy cần

phải làm thí nghiệm nhanh. Tốt nhất là thực hiện thí nghiệm liên tục,

không ngắt quảng. Ví dụ tách chiết các enzyme chống oxy hóa

(antioxidant enzyme) ở ty thể trong vòng 6h và đo luôn nếu không thì mất

hoạt tính. Còn ở microsome thì tiến trình có thể kéo dài hơn vẫn

20