cac phuong phap tinh sach enzyme

Gvhd :Ths Đặng Thị Ngọc Dung Hóa Sinh Thực phẩm

LỜI MỞ ĐẦU

Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, các

chế phẩm enzyme được sản xuất càng nhiều và được sử dụng trong hầu hết

trong các lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế…

Hàng năm lượng enzyme được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000

tấn với giá trị trên 500 triệu USD, được phân phối trong các lĩnh vực khác

nhau. .

Phần lớn enzyme được sản xuất ở quy mô công nghiệp đều thuộc loại

enzyme đơn cấu tử, xúc tác cho phản ứng phân hủy. Khoảng 75% chế phẩm

là enzyme thủy phân được sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên .

Protease là enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành sản

xuất như: chế biến thực phẩm (đông tụ sữa làm pho mát, làm mềm thịt, bổ

sung để làm tăng chất lượng sản phẩm trong sản xuất bia, xử lý phế phụ phẩm

trong chế biến thực phẩm…), sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da, y tế, nông

nghiệp…

Qua nhiều năm, việc gia tăng sử dụng vi sinh vật như là một nguồn cung

cấp protease đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm được tạo ra

nhiều hơn. Tuy nhiên giá thành chế phẩm protease còn khá cao, do đó cũng

Các phương pháp tinh sạch enzyme 1

Gvhd :Ths Đặng Thị Ngọc Dung Hóa Sinh Thực phẩm

hạn chế việc sử dụng rộng rãi enzyme trong sản xuất. Các chế phẩm thu được

sau quá trình nuôi cấy sản xuất enzyme chưa phải là chế phẩm có độ tinh

khiết cao vì protein chỉ chiếm 20-30% .Vì vậy, việc nghiên cứu cải tiến

phương pháp tách và tinh chế enzyme nhằm thu được chế phẩm có độ tinh

khiết cao rất cần thiết. Để tách và tinh chế enzyme nói riêng và protein nói

chung thường có một loạt phương pháp hóa-lý và hóa học khác nhau. Có thể

chia làm năm nhóm phương pháp sau:

- Phương pháp biến tính chọn lọc

- Phương pháp kết tủa phân đọan

- Phương pháp hấp thụ chọn lọc

- Phương pháp sắc ký

- Phương pháp tách hệ hai pha nước

Cho đến nay không có phương pháp tách và làm sạch chung cho các

enzyme. Để xây dựng phương pháp tách và làm sạch một enzyme nào dó cần

biết lựa chọn và phối hợp một cách có hiệu quả nhất các biện pháp tách và

làm sạch khác nhau.

PHẦN I: TỔNG QUAN

Các phương pháp tinh sạch enzyme 2

Gvhd :Ths Đặng Thị Ngọc Dung Hóa Sinh Thực phẩm

I/Khái niệm enzyme

- Enzyme là những protein có khả năng xúc tác cho các phản ứng hoá

học với mức độ đặc hiệu khác nhau ở nhiệt độ tương đối thấp.

- Enzyme có trong tất cả các tế bào sống, là các chất xúc tác sinh học.

- Enzyme có đầy đủ các tính chất của chất xúc tác, nhưng enzyme có

hiệu suất xúc tác lớn hơn tất cả các chất xúc tác hữu cơ và vô cơ khác.Enzyme

không những có thể xúc tác cho các phản ứng xảy ra trong cơ thể sống, mà

sau khi tách khỏi hệ thống sống, ở những điều kiện nhất định chúng vẫn giữ

được hoạt tính xúc tác.

Như vậy,có thể nói một cách khái quát, enzyme là những phân tử lớn

tồn tại trong tự nhiên, hay được tổng hợp có khả năng xúc tác cho một hay

nhiều phản ứng với mức độ đặc hiệu khác nhau ở nhiệt độ và áp suất bình

thường.

II/Những tiêu chuẩn tinh sạch của enzyme

Để xác định xem protein được chiết tách ra có phải là enzyme tinh

khiết không hay còn chứa những tạp chất protein không họat động, người

ta sử dụng một số phương pháp chủ yếu dựa trên việc nghiên cứu những

tính chất vật lý của protein.

Các phương pháp tinh sạch enzyme 3

Gvhd :Ths Đặng Thị Ngọc Dung Hóa Sinh Thực phẩm

- Làm lắng (kết tủa) dung dịch protein trong phần quay phân tích của

máy siêu ly tâm: phát hiện một đỉnh của protein thì đó là protein

thuần nhất. Tuy nhiên một số protein tuy khác nhau nhưng có cùng

trọng lượng phân tử và có hình dạng tiểu phân ( hoặc có khi có sự bù

phụ của các ảnh hưởng của khối lượng và hình dạng) thì có hằng số

lắng trùng nhau. Vì thế khi siêu ly tâm, chúng có thể lắng với tốc độ

như nhau và cho một đỉnh chung.

- Điện li ( phương pháp ranh giới di động): phương pháp này rất hiệu

quả. Tuy nhiên khó mà phân biệt được những protein giống nhau về

trị số di động điện li. Dung dịch enzyme khi được điện li khu vực

trong jela tinh bột hoặc thạch chỉ ra một đỉnh cân đối thì đó là dấu

hiệu của enzyme thuần nhất. Thế nhưng khi hàm lượng những

protein tạp nhỏ(<=1%) thì khó phát hiện ra đúng.

- Xác định họat độ riêng, mật độ quang học riêng trong những đỉnh

quang phổ đặc trưng cùng hàm lượng các nhóm ngọai đặc hiệu.

- Biện pháp khá nhạy cảm để xác định mức độ thuần nhất của enzyme

( cũng như protein khác) là kết hợp sự phân tích điện li và những

phản ứng miễn dịch hóa học đặc hiệu, đặc biệt điện di trên thạch

theo grabar.

Các phương pháp tinh sạch enzyme 4

Gvhd :Ths Đặng Thị Ngọc Dung Hóa Sinh Thực phẩm

- Biện pháp nghiên cứu có triển vọng nhưng tương đối ít nhạy về độ

thuần nhất của protein là sự xác định độ hòa tan của nó theo

norchrop.

Thường để xét độ thuần nhất của enzyme, người ta dựa trên sự so

sánh những kết quả thu được từ một vài phương pháp khác nhau.

Đặc biệt, những chế phẩm enzyme càng tinh khiết thì càng dễ hỏng

và khi bảo quản trong các dung dịch ở 40C đều nhanh chóng mất hoạt

tính. Vì thế, khi tái kết tinh enzyme lặp lại ta thường thấy có sự giảm

hoạt độ riêng vì các tinh thể đã bị ô nhiễm bởi phần enzyme bị ức chế.

Các phương pháp tinh sạch enzyme 5