Bước đầu tách và nuôi cấy tiểu đảo langerhans từ chuột nhắt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH

LÊ THỊ KIM ANH

BƯỚC ĐẦU TÁCH VÀ NUÔI CẤY

TIỂU ĐẢO LANGERHANS TỪ CHUỘT NHẮT

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021

.

.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH

LÊ THỊ KIM ANH

BƯỚC ĐẦU TÁCH VÀ NUÔI CẤY

TIỂU ĐẢO LANGERHANS TỪ CHUỘT NHẮT

NGÀNH: DƯỢC LÝ VÀ DƯỢC LÂM SÀNG

MÃ SỐ: 8720205

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. ĐỖ THỊ HỒNG TƯƠI

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021

.

.

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu và thông tin

trong bài luận văn là trung thực, chính xác và chưa được công bố trong bất kỳ bài

nghiên cứu nào khác.

Tác giả luận văn

Lê Thị Kim Anh

.

.

TÓM TẮT

Luận văn thạc sĩ – Khóa 2019 – 2021

Chuyên ngành: Dược lý và dược lâm sàng

BƯỚC ĐẦU TÁCH VÀ NUÔI CẤY

TIỂU ĐẢO LANGERHANS TỪ CHUỘT NHẮT

Lê Thị Kim Anh

GVHD: PGS. TS. Đỗ Thị Hồng Tươi

Mở đầu: Đái tháo đường có thể là nguyên nhân gây tử vong cho người bệnh, liên

quan các biến chứng trên tim mạch, thận, mắt, chi,... Hiện nay, các mô hình gây tổn

thương tiểu đảo tụy phân lập từ chuột được sử dụng trong nghiên cứu sàng lọc, phát

triển nguyên liệu/sản phẩm có khả năng phòng và/hoặc điều trị bệnh đái tháo đường.

Tuy nhiên, các báo cáo về phân lập tiểu đảo Langerhans ở Việt Nam vẫn còn hạn chế.

Vì vậy, đề tài tiến hành nghiên cứu “Bước đầu tách và nuôi cấy tiểu đảo Langerhans

từ chuột nhắt”.

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu:

Tụy chuột nhắt chủng Swiss albino được ủ với enzym collagenase ở 37

oC trong 15,

20, 25, 30 phút. Các tiểu đảo được thu nhận bằng phương pháp ly tâm theo gradient

tỷ trọng và nuôi ổn định trong môi trường RPMI 1640, bổ sung 10% FBS và 1%

penicillin/streptomycin ở 37

oC, 5% CO2 trong 24, 48, 72 giờ với mật độ 70, 100,

130, 160 tiểu đảo/giếng. Dựa trên hình thái, số lượng, tỷ lệ tế bào sống và khả năng

tiết insulin của tiểu đảo, đề tài chọn các thông số ảnh hưởng quy trình phân lập thích

hợp.

Các tiểu đảo Langerhans sau khi phân lập và nuôi ổn định, được xử lý với glucose

nồng độ 20 mM hoặc 30 mM trong 24, 48, 72 giờ, đánh giá hình thái và tỷ lệ tế bào

sống để chọn mô hình in vitro gây tổn thương tiểu đảo thích hợp.

.

.

i

Kết quả:

Tụy chuột được ủ với enzym collagenase trong 30 phút ở 37

oC, các tiểu đảo phân

lập được nuôi ổn định trong đĩa 6 giếng ở mật độ 100 tiểu đảo/giếng/3 ml môi trường

(tương ứng 11 tiểu đảo/cm2

) trong 24 giờ.

Xử lý tiểu đảo tụy với glucose nồng độ 30 mM trong 72 giờ giảm 49,45% tỷ lệ tế bào

sống, nồng độ insulin khác biệt không đáng kể so với mẫu sinh lý ở môi trường

glucose 2,8 mM. Thuốc đối chứng dương glimepirid nồng độ 10 µM giảm 62,73% tỷ

lệ tế bào sống, nồng độ insulin thấp hơn 1,01 – 1,09 lần so với sinh lý.

Kết luận: Tiểu đảo Langerhans phân lập từ chuột nhắt Swiss albino được nuôi ổn

định ở mật độ 11 tiểu đảo/cm2

trong 24 giờ trước khi tiến hành các thử nghiệm khác.

Việc nuôi cấy ở môi trường glucose 30 mM trong 72 giờ gây độc tính trên tiểu đảo

Langerhans, chủ yếu ảnh hưởng đến khả năng sống của tế bào, không tác động nhiều

đến sự tiết insulin của tế bào β.

Từ khóa: Tiểu đảo Langerhans, glucose nồng độ cao, in vitro, Swiss albino, đái tháo

đường.

.

.

ABSTRACT

Master's thesis – Academic course 2019 – 2021

Speciality: Pharmacology and clinical pharmacology

FIRST STEPS OF ISOLATION AND CULTURE

LANGERHANS ISLET FROM MICE

Le Thi Kim Anh

Supervisor: Assoc. Prof. Dr. Do Thi Hong Tuoi

Introduction: Diabetes can be a cause of death for patients, related to complications

of cardiovascular, kidney, eye, limb... Currently, models of injury pancreatic islet

isolated from mice are used in research, screening and development of

materials/products with the potential to prevent and/or treat diabetes. However,

reports on isolation of Langerhans islets in Viet Nam are still limited. Therefore, this

study conducted "First steps of isolation and culture of Langerhans islets from mice"

Materials and Methods:

Swiss albino mice pancreas was incubated with collagenase enzyme at 37

oC for 15,

20, 25, 30 minutes. The islets were collected by density gradient centrifugation and

stabilized in RPMI 1640 medium, supplemented with 10% FBS and 1%

penicillin/streptomycin at 37 °C, 5% CO2 for 24, 48, and 72 h. with density 70, 100,

130, 160 islets/well. Based on the morphology, number, percentage of cell viability

and insulin secretion ability of the islets, the study selected the parameters affecting

the isolation process.

Langerhans islets after isolation and stable culture, were treated with glucose

concentration of 20 mM or 30 mM for 24, 48, 72 hours. This study evaluated

morphology and percentage of cell viability to choose an in vitro model to cause

injure islet.

.

.

Results:

The pancreas was incubated with collagenase enzyme for 30 minutes at 37

oC, the

islets were stably grown in a 6-well plate at a density of 100 islets/well/3 ml of

medium (corresponding to 11 islets/cm2

) in 24 hours.

Treating pancreatic islets with glucose concentration of 30 mM for 72 hours reduced

survival rate by 49,45%, insulin concentration was not significantly different from

physiological samples in 2,8 mM glucose medium. The positive control drug

glimepiride with concentration of 10 µM reduced 62,73% the percentage of cell

viability, and insulin concentration was 1,01 – 1,09 times lower than physiological.

Conclusion: Langerhans islets isolated from Swiss albino mice were stabilized at a

density of 11 islets/cm2

for 24 hours before conducting other experiments. Culture in

30 mM glucose for 72 hours caused toxicity in the islets of Langerhans, mainly

affecting cell viability, but not much effect on insulin secretion of β-cells.

Keywords: islet of Langerhans, high glucose concentration, in vitro, Swiss albino,

diabetes.

.

.

i

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ĐOAN.......................................................................................................................... i

MỤC LỤC..................................................................................................................................... vi

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................................. viii

DANH MỤC BẢNG................................................................................................................... ix

DANH MỤC HÌNH..................................................................................................................... x

MỞ ĐẦU......................................................................................................................................... 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ..................................................................................................... 3

1.1. Đái tháo đường...................................................................................................................... 3

1.2. Tổng quan về tụy .................................................................................................................. 9

1.3. Một số mô hình điều trị đái tháo đường và gây tổn thương tế bào β.................... 16

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................ 22

2.1. Đối tượng nghiên cứu........................................................................................................ 22

2.2. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................................. 24

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU............................................................................ 32

3.1. Khảo sát một số thông số ảnh hưởng quy trình phân lập tiểu đảo Langerhans từ

chuột nhắt...................................................................................................................................... 32

3.2. Khảo sát nồng độ glucose gây độc trên tiểu đảo Langerhans................................. 42

CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN....................................................................................................... 47

CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 50

5.1. Kết luận ................................................................................................................................. 50

5.2. Kiến nghị............................................................................................................................... 50

.

.