Bước đầu nghiên cứu tổng hợp interleukin 33 người tái tổ hợp trên escherichia coli

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH



NGUYỄN KIM HƯNG

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP

INTERLEUKIN-33 NGƯỜI TÁI TỔ HỢP

TRÊN ESCHERICHIA COLI

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, 2022

.

.

ii

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH



NGUYỄN KIM HƯNG

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP

INTERLEUKIN-33 NGƯỜI TÁI TỔ HỢP

TRÊN ESCHERICHIA COLI

NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT

MÃ SỐ: 8720210

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN QUỐC THÁI

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, 2022

.

.

iii

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận văn “Nghiên cứu tạo Interleukin-33 người tái tổ hợp

trên Escherichia coli” là bài viết của riêng tôi, với các thông tin được được trích dẫn

trong luận văn đều được ghi rõ nguồn gốc.

Tác giả luận văn

Nguyễn Kim Hưng

.

.

iv

Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ Dược học khóa: 2019-2021

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP

INTERLEUKIN-33 NGƯỜI TÁI TỔ HỢP

TRÊN ESCHERICHIA COLI

Nguyễn Kim Hưng

Thầy hướng dẫn: TS. Nguyễn Quốc Thái

TÓM TẮT

Mở đầu: Interleukin-33 (IL-33) là một thành viên trong họ Interleukin-1. Có

vai trò quan trọng trong các bệnh tự miễn và gần đây nhất thì cũng có nghiên cứu cho

thấy có sự tăng cao IL-33 của các bệnh nhân nhiễm covid trẻ tuổi liên quan đến cơn

bão cytokine. Cho thấy hướng nghiên cứu về IL-33 và thụ thể của nó là một mục tiêu

tiềm năng. Để thực hiện nghiên cứu cần chủ động nguồn IL-33 cho nghiên cứu vì IL￾33 chưa được sản xuất thương mại và giá thành đặt mua rất đắt. Nên đó là lí do đề tài

này được thực hiện với mong muốn tạo nguồn IL-33 với độ tinh khiết cao phục vụ

cho nghiên cứu.

Đối tượng - Phương pháp nghiên cứu: Chủng vi khuẩn sử dụng là E. coli

mang vector biểu hiện pET-SUMO-IL-33. Biểu hiện trong môi trường ZYP-5052 ở

25 °C, thu nhận và tinh chế IL-33 dạng tan bằng phương pháp sắc kí ái lực trên cột

Ni-Sepharose. IL-33 dạng nguyên thể được định lượng bằng phương pháp Bradford

và bộ kit ELISA. Khảo sát in silico tiềm năng của IL-33 ở dạng gắn kết với SUMO

và dạng tự nhiên trong nghiên cứu tương tác với thụ thể ST2.

Kết quả: Vi khuẩn được nuôi cấy 40 giờ trong môi trường ZYP-5052 nhiệt độ

25 °C. Loại bỏ đoạn dung hợp SUMO thu IL-33 nguyên thể là 38,56 mg hiệu suất

17,4% . Xây dựng mô Hình 3D của SUMO-IL33 và IL-33, đánh giá khả năng gắn kết

với thụ thể ST của IL-33 chứa đoạn dung hợp SUMO.

Kết luận: Nghiên cứu tạo thành công IL-33 nguyên thể với hiệu suất 17,4%.

Đánh giá được IL-33 chứa đoạn dung hợp SUMO không thể sử dụng trong các thử

nghiệm có mặt thụ thể ST2.

.

.

v

Final esay for the degree of M.Sc in Pharm. - Academic year: 2019-2021

FIRST STEP TO RESEARCH EXPRESSION OF

RECOMBINANT HUMAN INTERLEUKIN-33

IN ESCHERICHIA COLI

Kim-Hung Nguyen

Supervisor: Dr. Nguyen Quoc Thai

ABSTRACT

Background: Interleukin-33 (IL-33) is a member of the Interleukin-1 family.

They play an important role in autoimmune diseases and most recently there was also a

study showing elevated IL-33 in young covid patients associated with a cytokine storm.

Showsthe direction of research on IL-33 and itsreceptor as a potential target. To conduct

research, it is necessary to actively source IL-33 for research because IL-33 has not been

produced commercially and the purchase price is very expensive. So that's why thisstudy

was carried out with the desire to create a source of IL-33 with high purity for research

purposes.

Method: E. coli containing the pET-SUMO-IL-33 construction expressing

recombinant in ZYP-5052 at 25 °C. Recomninant IL-33 was purified by IMAC with

Ni-Sepharose. IL-33 native were quantified by Bradford method and kit ELISA.

Investigation of the potential in silico of IL-33 in SUMO-binding and native form

in ST2 receptor interaction studies.

Results: E.coli were cultured for 40 h in ZYP-5052 medium at 25 °C. Removal

of the SUMO fusion fragment yielded native IL-33 of 38,56 mg with a 17,4% yield.

Building 3D models of SUMO-IL33 and IL-33, assessing the ability to bind to ST2

receptor of IL-33 containing the SUMO fusion fragment.

Conclusion: Research to create native IL-33 with 17,4% efficiency. Evaluation

of IL-33 containing the SUMO fusion fragment could not be used in assays for the

presence of the ST2 receptor.

.

.

vi

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên em xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy TS Nguyễn Quốc Thái đã tạo cơ hội

cho em tiếp cận với mảng nghiên cứu protein. Cảm ơn thầy đã tận tình hướng dẫn,

luôn động viên cũng như định hướng, tháo gỡ những khó khăn vướng mắc cho em

trong thời gian thực hiện nghiên cứu. Cám ơn Thầy về tất cả những gì Thầy đã chỉ

dạy.

Cảm ơn dược sĩ Tôn Thảo Vy đã luôn đồng hành trong suốt khoảng thời gian qua,

luôn chia sẻ khó khăn, luôn động viên và đưa ra lời khuyên hữu ích.

Cảm ơn anh chị kỹ thuật viên bộ môn Sinh hóa, cô TS Vũ Thanh Thảo Trung tâm

Sapharcen đã tạo điều kiện tốt nhất cũng như đã chỉ dạy em trong thời gian em thực

hiện đề tài.

Cảm ơn anh chị nghiên cứu sinh Mai Thành Tấn, Trần Quế Hương, Trần Thị Thúy

Nga, các tân dược sĩ Lê Nhật Hạ, Nguyễn Minh Thư, Nguyễn Duy Thạch lớp D16 đã

đồng hành và cùng nhau nghiên cứu.

Cảm ơn gia đình đã tạo điều kiện cho con có thể học tập, luôn động viên con có thể

vượt qua khó khăn thử thách.

Trân trọng,

Nguyễn Kim Hưng

.

.

vii

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT............................................................ix

DANH MỤC BẢNG....................................................................................... xi

DANH MỤC HÌNH.......................................................................................xii

MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN........................................................................... 3

1.1 Tổng quan về Interleukin...........................................................................................3

1.2 Tổng quan về Interleukin-33......................................................................................3

1.3 Sản xuất protein tái tổ hợp bằng vi khuẩn Escherichia coli ......................................7

1.4 Vector biểu hiện pET-SUMO....................................................................................9

1.5 Tinh chế protein .......................................................................................................10

1.6 Tạo protein dạng nguyên thể bằng phản ứng thuỷ phân với SUMO Protease.........12

1.7 Kiểm định protein ....................................................................................................13

1.8 Xây dựng mô hình tương đồng mô phỏng cấu trúc protein.....................................16

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......... 19

2.1 Vật liệu nghiên cứu..................................................................................................19

2.2 Phương pháp nghiên cứu .........................................................................................25

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.................................................... 37

3.1 Khảo sát điều kiện nuôi cấy.....................................................................................37

3.2 Tinh chế SUMO-IL-33 ............................................................................................42

3.3 Khảo sát điều kiện thủy phân SUMO-IL33 để thu IL-33 nguyên thể (native)........44

3.4 Tinh chế IL-33 nguyên thể với cột Ni Sepharose ....................................................47

3.5 Định lượng IL-33 bằng bộ KIT ELISA ...................................................................49

3.6 Mô hình cấu trúc 3D của IL-33 dạng gắn với SUMO xây dựng bằng kỹ thuật

homology .............................................................................................................................49

3.7 Kết quả docking protein-protein khảo sát sự gắn kết của SUMO-IL-33 với thụ thể

ST2...........................................................................................................................58

CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN............................................................................. 63

4.1 Nhận xét về kết quả nuôi cấy và tinh chế ................................................................63

4.2 So sánh với các nghiên cứu khác .............................................................................66

.

.

viii

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ........................................................................... 68

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

.

.

ix

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Từ viết đầy đủ bằng tiếng Việt, tiếng Anh

3D

APS

bp

Cấu trúc không gian ba chiều

Ammonium persulfat

Base pait

Co

2+

- CMA Cobalt - carboxylmethylaspartate

DDT Dithiotheitol

EIA Enzym immunoassay

ELISA Enzym-linked immunosorbent assay

IDA Acid iminodiacetic

hIL-33

IL-33

IL

Interleukin-33 người

Interleukin-33

Interleukin

IL-1RAcP Đồng thụ thể của IL-33 (Interleukin-1 Receptor accessory

Protein)

IMAC Immobilized metal ion affinity chromatography

IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

LB

NF-HEV

Luria-Bertani Broth

Nuclear factor − high endothelial venule

Ni

2+

- NTA

NPS

Nickel – nitriloacetic acid

Hỗn hợp Na2HPO4, KH2PO4, (NH4)2SO4

SDS Sodium dodecyl sulfat

SDS-PAGE

SOC

Phương pháp điện di gel natri dodecyl sulfat trên

polyacrylamid (Sodium Dodecyl Sulfate–Polyacrylamide

Gel Electrophoresis)

Super Optimal broth with Catabolite repression

SUMO Small ubiquitin-like modifier

.

.