Bước đầu nghiên cứu thu nhận Bacteriocin từ vi khuẩn Lactobacillus plantarum Atcc8014 ứng dụng làm phụ gia thực phẩm

TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài:

BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THU NHẬN BACTERIOCIN

TỪ VI KHUẨN LACTOBACILLUS PLANTARUM ATCC8014

ỨNG DỤNG LÀM PHỤ GIA THỰC PHẨM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

GVHD: Th. S Nguyễn Thị Lệ Thủy

Th. S Nguyễn Thị Phƣơng Khanh

SVTH: Trần Thị Toán

MSSV: 1053010806

Khóa: 2010-2014

Bình Dƣơng, ngày 16 tháng 6 năm 2014

Nhớ ngày nào còn bỡ ngỡ khi bƣớc chân vào giảng đƣờng đại học nay gần bốn

năm học đã trôi qua, biết bao nhiêu kĩ niệm buồn vui cùng thầy cô và bạn bè giờ phải sắp

chia tay. Bốn năm ấy là một khoảng thời gian vô cùng quý báu cho bản thân em, khoảng

thời gian ấy đã giúp em tích lũy đƣợc nhiều kinh nghiệm và các kĩ năng cần thiết để bƣớc

vào cuộc sống muôn màu và chông gai phía trƣớc. Để có đƣợc những kiến thức ấy là nhờ

sự quan tâm chăm sóc của nhà trƣờng, sự dạy dỗ tận tình của thầy cô, sự chia sẽ, động

viên, giúp đỡ của gia đình và bạn bè.

Lời đầu tiên em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trƣờng Đại học Mở thành

phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện về vật chất và tinh thần để em có cơ hội học tập và

phấn đấu.

Lời cảm ơn tiếp theo em xin gửi đến các thầy cô khoa công nghệ sinh học đặc biệt

là các thầy cô trong chuyên ngành thực phẩm.

Tiếp theo em xin chân thành cảm ơn Giảng viên – Th.S Nguyễn Thị Phƣơng

Khanh cùng toàn thể các anh chị, các bạn bè và các em trong phòng thí nghiệm sinh hóa,

phòng thí nghiệm vi sinh-trƣờng Đại học Mở thành phố Hồ chí Minh đã tạo mọi điều

kiện và giúp đỡ em hoàn thành đề tài. Em xin chúc cô luôn luôn mạnh khỏe, gặt hái nhiều

thành công hơn nữa.

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đên cô Nguyễn Thị Lệ Thủy đã tận tình hƣớng

dẫn, giúp đỡ, động viên và truyền đạt những kiến thức quý báu trong suốt thời gian thực

hiện đề tài thực tập và khóa luận tốt nghiệp. Không chỉ truyền đạt kiến thức cần thiết mà

còn chỉ dạy em cách làm ngƣời và những kinh nghiệm trong cuộc sống. Một lần nữa em

cảm ơn cô, chúc cô luôn vui vẻ, khỏe mạnh bên gia đình, ngƣời thân và bạn bè, chúc cô

gặt hái thêm nhiều thành công hơn nữa trong cuộc sống.

Lời cuối cùng em xin cảm ơn đến ba mẹ, ngƣời đã cho em đến với cuộc đời này,

ngƣời đã nuôi dạy và tạo mọi điều kiện tốt nhất để em học tập, tiếp xúc với cuộc đời, với

thầy cô, bạn bè, với những cơ hội đang chờ em trong tƣơng lai. Con xin cảm ơn ba mẹ,

con chúc ba mẹ lời chúc sức khỏe, luôn luôn cƣời trong cuốc sống đầy chông gai này.

MỤC LỤC

DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT ...............................................................................i

DANH MỤC BẢNG ...........................................................................................................ii

DANH MỤC HÌNH............................................................................................................iii

ĐẶT VẤN ĐỀ..................................................................................................................... 1

PHẦN 1: TỔNG QUAN...................................................................................................... 3

1.1. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN LACTIC.................................................................... 4

1.1.1. Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic.......................................................................... 4

1.1.2. Phân loại vi khuẩn lactic............................................................................................ 5

1.1.3. Nhu cầu dinh dƣỡng của vi khuẩn lactic ................................................................... 6

1.1.4. Hoạt động sinh hóa, trao đổi chất của vi khuẩn lactic............................................... 7

1.2. GIỚI THIỆU VỀ VI KHUẨN LACTOBACILLUS PLANTARUM.............................. 8

1.2.1. Đặc điểm.................................................................................................................... 8

1.2.2. Vai trò ....................................................................................................................... 8

1.2.3. Cơ cấu gen ................................................................................................................. 9

1.2.4. Sinh thái học và sinh lý bệnh..................................................................................... 9

1.3. TỔNG QUAN VỀ BACTERIOCIN .......................................................................... 10

1.3.1. Định nghĩa ............................................................................................................... 10

1.3.2. Bacteriocin từ LAB ................................................................................................. 11

1.3.3. Phân loại bacteriocin ............................................................................................... 12

1.3.4. Đặc tính của bacteriocin .......................................................................................... 13

1.3.6. Phổ hoạt động của bacteriocin................................................................................. 15

1.3.7. Phƣơng thức hoạt động của bacteriocin .................................................................. 15

1.3.8. Ứng dụng của bacteriocin........................................................................................ 16

PHẦN 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................... 22

2.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN ĐỀ TÀI................................................. 23

2.1.1. Thời gian.................................................................................................................. 23

2.1.2. Địa điểm .................................................................................................................. 23

2.1.3. Môi trƣờng............................................................................................................... 23

2.2. VẬT LIỆU THÍ NGHIỆM ......................................................................................... 24

2.2.1. Chủng vi sinh vật..................................................................................................... 24

2.2.2. Hóa chất................................................................................................................... 24

2.3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................. 25

2.3.1. Phƣơng pháp nghiên cứu ......................................................................................... 25

2.3.2. Sơ đồ nghiên cứu..................................................................................................... 25

2.3.3. Sơ đồ nội dung thí nghiệm ...................................................................................... 26

2.3.4. Nội dung thực hiện .................................................................................................. 27

2.3.4.1. Khảo sát sự sinh trƣởng của vi khuẩn Lactobacillus plantarum ATCC8014. ..... 27

2.3.4.2. Khảo sát sự ảnh hƣởng của nguồn carbon đến quá trình sinh tổng hợp

bacteriocin Lactobacillus plantarum ATCC8014. .............................................. 29

2.3.4.3. Khảo sát sự ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến quá trình sinh tổng hợp bacteriocin.30

2.3.4.4. Khảo sát sự ảnh hƣởng giữa tỷ lệ nguồn carbon và nitơ đến quá trình sinh tổng

hợp bacteriocin Lactobacillus plantarum ATCC8014. ....................................... 31

2.3.4.5. Khảo sát các điều kiện nuôi cấy ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp

bacteriocin……………….. ................................................................................. 32

2.3.4.5.1. Khảo sát sự ảnh hƣởng của pH đến quá trình tổng hợp bacteriocin ................. 32

2.3.4.5.2. Khảo sát sự ảnh hƣởng của thời gian đến quá trình sinh tổng hợp bacteriocin.33

2.3.4.5.3. Khảo sát sự ảnh hƣởng của nhiệt độ đến quá trình sinh tổng hợp bacteriocin.. 34

2.3.4.6. Khảo sát sự ảnh hƣởng của tác nhân cồn 960

đến quá trình thu nhận

bacteriocin…........................................................................................................ 35

PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN........................................................................... 38

3.1. Khảo sát sự sinh trƣởng của vi khuẩn Lactobacillus plantarum ATCC8014. ........... 39

3.2. Khảo sát sự ảnh hƣởng của nguồn carbon đến quá trình sinh tổng hợp bacteriocin.. 42

3.3. Khảo sát sự ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến quá trình sinh tổng hợp bacteriocin. ..... 44

3.4. Khảo sát sự ảnh hƣởng giữa tỷ lệ nguồn carbon và nitơ đến quá trình

sinh tổng hợp bacteriocin............................................................................................ 47

3.5. Khảo sát các điều kiện nuôi cấy ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp

bacteriocin…. ............................................................................................................. 51

3.5.1. Khảo sát sự ảnh hƣởng của pH đến quá trình tổng hợp bacteriocin ....................... 51

3.5.2. Khảo sát sự ảnh hƣởng của thời gian đến quá trình sinh tổng hợp bacteriocin. ..... 54

3.6. Khảo sát sự ảnh hƣởng của tác nhân cồn 960

đến quá trình thu nhận bacteriocin. .... 59

3.7. Khảo sát sự ảnh hƣởng của tác nhân muối (NH4)2SO4 đến quá trình thu nhận

bacteriocin................................................................................................................... 60

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ........................................................................................... 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................................. 66

PHỤ LỤC ............................................................................................................................ii

Báo cáo khóa luận tốt nghiệp GVHD: Th.S Nguyễn Thị Lệ Thủy

SVTH: Trần Thị Toán i

DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT

Kí hiệu viết tắt Diễn giải

CFU Colony Forming Unit

h Hour

LAB Lactic Acid Bacteria

MRS De man, Rogosa, Sharpe

MRSA De man, Rogosa, Sharpe, Agar

NA Nutrient Agar

NB Nutrient broth

OD Optical density

pH Potential Hydrogen

ĐK Đƣờng kính

Báo cáo khóa luận tốt nghiệp GVHD: Th.S Nguyễn Thị Lệ Thủy

SVTH: Trần Thị Toán ii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Đặc tính lí học của một số bacteriocin đƣợc sinh tổng hợp bởi vi khuẩn

Gram dƣơng. ..................................................................................................... 14

Bảng 2.1: Môi trƣờng nuôi cấy và giữ giống vi khuẩn Lactobacillus plantarum

ATCC8014........................................................................................................ 23

Bảng 2.2: Môi trƣờng nuôi cấy và giữ giống vi khuẩn gây bệnh Bacillus cereus

và thử hoạt tính kháng khuẩn của bacteriocin. ................................................. 24

Bảng 2.3: Nguồn carbon và nồng độ nguồn carbon .......................................................... 29

Bảng 2.4: Nguồn nitơ và nồng độ nguồn nitơ ................................................................... 30

Bảng 2.5: Tỷ lệ nguồn carbon và nitơ ............................................................................... 31

Bảng 2.6: Các giá trị pH khảo sát...................................................................................... 32

Bảng 2.7: Các giá trị thời gian khảo sát ............................................................................ 33

Bảng 2.8: Các giá trị nhiệt độ khảo sát.............................................................................. 34

Bảng 2.9: Tác nhân tủa và tỉ lệ tủa để thu nhận bacteriocin.............................................. 35

Bảng 2.10: Tác nhân tủa và tỉ lệ tủa để thu nhận bacteriocin............................................ 36

Bảng 3.1: Số khuẩn lạc trung bình trong 1ml dung dịch mẫu theo thời gian.................... 39

Bảng 3.2: Ảnh hƣởng của nguồn carbon đến quá trình tổng hợp bacteriocin................... 42

Bảng 3.3: Ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến quá trình sinh tổng hợp bacteriocin................ 45

Bảng 3.4: Ảnh hƣởng giữa tỷ lệ nguồn carbon và nitơ đến quá trình sinh tổng hợp

bacteriocin......................................................................................................... 48

Bảng 3.5: Ảnh hƣởng của pH đến quá trình sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn

Lactobacillus plantarum ATCC8014. .............................................................. 51

Bảng 3.6: Ảnh hƣởng của thời gian đến quá trình sinh tổng hợp bacteriocin................... 55

Bảng 3.7: Ảnh hƣởng của thời gian đến quá trình sinh tổng hợp bacteriocin

của vi khuẩn Lactobacillus plantarum ATCC8014.......................................... 58

Bảng 3.8: Ảnh hƣởng của cồn 960

đến quá trình thu nhận bacteriocin............................. 59

Bảng 3.9: Ảnh hƣởng của muối (NH4)2SO4 đến quá trình thu nhận bacteriocin .............. 61

Báo cáo khóa luận tốt nghiệp GVHD: Th.S Nguyễn Thị Lệ Thủy

SVTH: Trần Thị Toán iii

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Khuẩn lạc của vi khuẩn Lactobacillus plantarum............................................... 8

Hình 1.2: Hình thái của vi khuẩn Lactobacillus plantarum….. .......................................... 8

Hình 1.3: Cấu trúc của nisin .............................................................................................. 11

Hình 2.1: Sơ đồ nội dung thí nghiệm ................................................................................ 26

Hình 3.1: Đƣờng cong tăng trƣởng của vi khuẩn Lactobacillus plantarum ATCC8014.. 40

Hình 3.2: Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn L.plantarum ATCC8014.................................... 41

Hình 3.3: Khả năng kháng khuẩn của bacteriocin ở các nguồn carbon khác nhau........... 44

Hình 3.4: Khả năng kháng khuẩn của bacteriocin khi sử dụng các nguồn nitơ

khác nhau .......................................................................................................... 47

Hình 3.5: Khả năng kháng khuẩn của bacteriocin khi sử dụng tỷ lệ nguồn carbon

và nitơ khác nhau .............................................................................................. 51

Hình 3.6: Ảnh hƣởng của pH đến khả năng kháng năng kháng khuẩn của bacteriocin. .. 54

Hình 3.7: Ảnh hƣởng của thời gian đến khả năng kháng năng kháng khuẩn của

bacteriocin của chủng Lactobacillus plantarum ATCC8014. .......................... 57

Hình 3.8: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng kháng khuẩn của bacteriocin............... 59

Hình 3.9: Ảnh hƣởng của cồn 960

đến khả năng kháng khuẩn của bacteriocin................ 60

Hình 3.10: Ảnh hƣởng của tác nhân tủa muối (NH4)2SO4 đến hoạt tính kháng khuẩn

của bacteriocin. ................................................................................................. 62

Báo cáo khóa luận tốt nghiệp GVHD: Th.S Nguyễn Thị Lệ Thủy

SVTH: Trần Thị Toán Trang 1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bacteriocin là một loại protein đƣợc tổng hợp bởi vi khuẩn. Nó có khả năng ức

chế sự phát triển của những loại vi khuẩn có cấu trúc tƣơng tự. Bacteriocin đƣợc

A.Gratia tìm thấy đầu tiên năm 1925. Ông thực hiện công trình nghiên cứu tìm cách tiêu

diệt vi khuẩn, kết quả của công trình này tác động mạnh đến sự phát triển của chất kháng

sinh và chất kháng khuẩn đƣợc sinh ra từ vi khuẩn.

Bacteriocin đa dạng về cấu trúc, chức năng, sinh thái. Bacteriocin có khả năng tiêu

diệt các vi khuẩn khác do sự tạo thành các kênh làm thay đổi tính thấm của màng tế bào,

nhiều loại bacteriocin còn có khả năng phân giải ADN, ARN và tấn công vào

peptidoglycan để làm suy yếu thành tế bào. Vì vậy bacteriocin đƣợc dùng nhiều trong

bảo quản thực phẩm, xử lý môi trƣờng, chế biến thức ăn chăn nuôi.

Vi khuẩn lactic hiện nay đƣợc quan tâm nhiều do chúng có khả năng sinh tổng hợp

nên bacteriocin. Vì thế việc nghiên cứu về vi khuẩn lactic và bacteriocin là một vấn đề

hết sức thiết thực và có ý nghĩa to lớn trong cuộc sống con ngƣời.

Vi khuẩn lactic đƣợc ứng dụng trong nhiều ngành sản xuất, đặc biệt là trong công

nghiệp thực phẩm và một số ngành chế biến khác vì chúng có khả năng sinh axit, tạo

hƣơng và kháng một số vi khuẩn nhờ khả năng sinh tổng hợp bacteriocin.

Trong công nghiệp thực phẩm, việc nghiên cứu tuyển chọn cũng nhƣ tạo ra những

chủng vi khuẩn lactic có khả năng tổng hợp bacteriocin cao để sử dụng trong quá trình

lên men lactic không chỉ nhằm mục đích bảo quản mà còn nhằm đƣa ra thị trƣờng các

loại sản phẩm có tính chất và hƣơng vị mong muốn. Các hƣớng ứng dụng của

bacteriocin chủ yếu gồm:

- Bảo quản thực phẩm

- Bảo quản các sản phẩm sữa

- Bổ sung vào thức ăn gia súc

- Muối chua rau quả

Báo cáo khóa luận tốt nghiệp GVHD: Th.S Nguyễn Thị Lệ Thủy

SVTH: Trần Thị Toán Trang 2

Những năm gần đây những nghiên cứu trên thế giới đã xác định đƣợc bản chất của

bacteriocin đồng thời xác định đƣợc một số loại bacteriocin do vi khuẩn lactic sinh ra và

khả năng ứng dụng của nó. Những công trình này đã có những đóng góp tích cực , nâng

cao chất lƣợng cuộc sống con ngƣời.

Đã có những nghiên cứu trong và ngoài nƣớc quan tâm đến việc sử dụng

bacteriocin do vi khuẩn lactic tổng hợp để bảo quản thực phẩm, thay thế các loại hoá chất

bảo quản độc hại đồng thời tạo ra các sản phẩm có chất lƣợng cao. Tuy nhiên để có thể

thu nhận đƣợc lƣợng bacteriocin cao nhất cần phải tối ƣu hóa môi trƣờng nuôi cấy vi

khuẩn.

Từ những vấn đề cấp thiết trên nên đề tài đƣợc đề xuất “Bƣớc đầu nghiên cứu

thu nhận bacteriocin từ vi khuẩn Lactobacillus plantarum ATCC8014 ứng dụng làm

phụ gia thực phẩm”.

Mục tiêu :

Tìm đƣợc điều kiện tối ƣu để thu đƣợc lƣợng chế phẩm bacteriocin cao nhất.

Báo cáo khóa luận tốt nghiệp GVHD: Th.S Nguyễn Thị Lệ Thủy

SVTH: Trần Thị Toán Trang 3

PHẦN 1: TỔNG QUAN