Bước đầu nghiên cứu quy trình phát hiện nhanh và đồng thời nhóm vi khuẩn gây bênh đường ruột dựa trên kỹ thuật PCR - Preverse Dot Blot / Trương Kim Phượng

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

----------------

BÁO CÁO TỔNG KẾT

Tên đề tài:

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH

PHÁT HIỆN NHANH VÀ ĐỒNG THỜI NHÓM

VI KHUẨN GÂY BỆNH ĐƯỜNG RUỘT DỰA

TRÊN KỸ THUẬT PCR- REVERSE DOT

BLOT (PCR-RDB)

Chủ nhiệm: ThS. Trương Kim Phượng

Thành viên: CN. Trần Huỳnh Minh Nhật

CN. Hồ Thị Thanh Thủy

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 4/2014

Trang i

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU, SƠ ĐỒ VÀ ĐỒ THỊ ...........................................................v

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH ...............................................................................................vi

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT...........................................................................................ix

ĐẶT VẤN ĐỀ............................................................................................................................1

PHẦN I. TỔNG QUAN .....................................................................................................3

I.1. SƠ LƯỢC VỀ CÁC NHÓM VI KHẨN GÂY BỆNH THƯỜNG GẶP ...................3

I.1.1. Bacillus cereus ........................................................................................................3

I.1.1.1. Đặc điểm hình thái............................................................................................3

I.1.1.2. Đặc điểm sinh hóa, sinh dưỡng ........................................................................3

I.1.1.3. Thông tin bộ gen...............................................................................................3

I.1.2. Brucella spp. ...........................................................................................................3

I.1.2.1. Đặc điểm hình thái............................................................................................3

I.1.2.2. Đặc điểm sinh hóa, sinh dưỡng ........................................................................4

I.1.2.3. Thông tin bộ gen...............................................................................................4

I.1.3. Clostridium botulinum............................................................................................4

I.1.3.1. Đặc điểm hình thái............................................................................................4

I.1.3.2. Đặc điểm sinh hóa, sinh dưỡng ........................................................................4

I.1.3.3. Thông tin bộ gen...............................................................................................5

I.1.4. Clostridium perfringens..........................................................................................5

I.1.4.1. Đặc điểm hình thái............................................................................................5

I.1.4.2. Đặc điểm sinh hóa, sinh dưỡng ........................................................................5

I.1.4.3. Thông tin bộ gen...............................................................................................6

I.1.5. Escherichia coli.......................................................................................................6

I.1.5.1. Đặc điểm hình thái............................................................................................6

I.1.5.2. Đặc điểm sinh hóa, sinh dưỡng ........................................................................6

I.1.5.3. Thông tin bộ gen...............................................................................................7

I.1.5.4. Phân loại ...........................................................................................................7

I.1.6. Listeria monocytogenes...........................................................................................8

I.1.6.1. Đặc điểm hình thái............................................................................................8

I.1.6.2. Đặc điểm sinh hóa, sinh dưỡng ........................................................................8

I.1.6.3. Thông tin bộ gen...............................................................................................8

Trang ii

I.1.7. Staphylococcus aureus............................................................................................9

I.1.7.1. Đặc điểm hình thái............................................................................................9

I.1.7.2. Đặc điểm sinh hóa, sinh dưỡng ........................................................................9

I.1.7.3. Thông tin bộ gen.............................................................................................10

I.1.8. Salmonella spp......................................................................................................10

I.1.8.1. Đặc điểm hình thái..........................................................................................10

I.1.8.2. Đặc điểm sinh hóa, sinh dưỡng ......................................................................10

I.1.8.3. Thông tin bộ gen.............................................................................................11

I.1.9. Shigella spp. ..........................................................................................................11

I.1.9.1. Đặc điểm hình thái..........................................................................................11

I.1.9.2. Đặc điểm sinh hóa, sinh dưỡng ......................................................................11

I.1.9.3. Thông tin bộ gen.............................................................................................12

I.1.10. Vibrio cholerae ......................................................................................................12

I.1.10.1. Đặc điểm hình thái..........................................................................................12

I.1.10.2. Đặc điểm sinh hóa, sinh dưỡng ......................................................................12

I.1.10.3. Thông tin bộ gen.............................................................................................13

I.1.11. Vibrio parahaemolyticus.......................................................................................13

I.1.11.1. Đặc điểm hình thái..........................................................................................13

I.1.11.2. Đặc điểm sinh hóa, sinh dưỡng ......................................................................13

I.1.11.3. Thông tin bộ gen.............................................................................................14

I.1.12. Yersinia enterocolitica ..........................................................................................14

I.1.12.1. Đặc điểm hình thái..........................................................................................14

I.1.12.2. Đặc điểm sinh hóa, sinh dưỡng ......................................................................14

I.1.12.3. Thông tin bộ gen.............................................................................................15

I.2. THÔNG TIN VÙNG GEN 16S VÀ 23S rDNA.........................................................15

I.2.1. Gen 16S rDNA......................................................................................................15

I.2.2. Gen 23S rDNA......................................................................................................16

I.3. CÁC KỸ THUẬT PHÁT HIỆN VI SINH VẬT GÂY BỆNH CHO CON NGƯỜI....17

I.3.1. Kỹ thuật định danh truyền thống [27] ...............................................................17

I.3.2. Kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại ....................................................................19

I.3.2.1. Kỹ thuật PCR[2][14].......................................................................................19

I.3.2.2. Multiplex PCR[14] .........................................................................................24

I.3.2.3. Phương pháp microarray [66][61] [14] ..........................................................24

Trang iii

I.3.2.4. Phương pháp Reverse dot blot [14].............................................................25

I.4. CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN NHANH CHÓNG VÀ ĐỒNG

THỜI TÁC NHÂN VI SINH VẬT GÂY BỆNH .................................................................26

PHẦN II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................................30

II.1. VẬT LIỆU....................................................................................................................30

II.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..............................................................................30

II.2.1. Thu thập dữ liệu và khảo sát in silico.................................................................30

II.2.2. Thu thập dữ liệu...................................................................................................30

II.2.3. Khảo sát in silico ..................................................................................................30

II.2.3.1. Thu thập trình tự gen mục tiêu 16S – 23S rRNA ...........................................30

II.2.3.2. Thu thập các cặp mồi......................................................................................30

II.2.3.3. Phương pháp khảo sát các cặp mồi, thiết kế mồi............................................31

II.2.4. Thực nghiệm.........................................................................................................31

II.2.4.1. Tách chiết DNA..............................................................................................31

II.2.4.2. Kiểm tra chất lượng DNA thu nhận bằng phương pháp đo quang phổ..........32

II.2.4.3. Phản ứng PCR: ...............................................................................................33

II.2.4.4. Phương pháp điện di:......................................................................................34

II.2.4.5. Phương pháp lai Reverse Dot Blot (RDB) .....................................................35

II.2.4.6. Khảo sát khả năng phát hiện đồng thời nhiều tác nhân vi khuẩn gây bệnh

cùng lúc 35

PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..........................................................................37

III.1. Kết quả thu thập dữ liệu và khảo sát in silico.......................................................37

III.1.1. Thu thập dữ liệu ...............................................................................................37

III.1.2. Kết quả khảo sát in silico.................................................................................38

III.1.2.1. Thu thập và đánh giá hệ cặp mồi, mẫu dò ..................................................38

III.1.2.2. Khảo sát các đặc tính của hai cặp mồi ........................................................39

III.1.2.3. Khảo sát các đặc tính của 12 mẫu dò..........................................................46

III.2. Kết quả thực nghiệm bước đầu xây dựng quy trình PCR-RDB nhằm phát hiện

nhanh và đồng thời nhóm 12 vi khuẩn gây bệnh đường ruột............................................70

III.2.1. Thử nghiệm bước tổng hợp màng lai:............................................................70

III.2.2. Thử nghiệm bước PCR với hai cặp mồi chung: ............................................70

III.2.3. Thử nghiệm bước lai RDB trên các chủng vi khuẩn đối chứng...................73

III.2.4. Kết quả phát hiện đồng thời các chủng vi khuẩn gây bệnh .........................75

III.2.5. Thử nghiệm quy trình trên mẫu bệnh phẩm.................................................77

Trang iv

PHẦN IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ..............................................................................85

IV.1. KẾT LUẬN ..............................................................................................................85

IV.2. ĐỀ NGHỊ..................................................................................................................85

TÀI LIỆU THAM KHẢO .....................................................................................................86

Trang v

1 DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU, SƠ ĐỒ VÀ ĐỒ THỊ

Bảng I.1. Bảng thử nghiệm sinh hóa phân biệt nhóm vi khuẩn gây bệnh đường

ruột[27]............................................................................................................................ 19

Bảng I.1. Bảng thử nghiệm sinh hóa phân biệt nhóm vi khuẩn gây bệnh đường

ruột[27]............................................................................................................................ 19

Bảng II.1. – Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi 16S_F – 16S_R...................... 33

Bảng II.2. – Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR với cặp mồi 16S_F – 16S_R ............ 33

Bảng II.3 – Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi 23S_F – 23S_R...................... 34

Bảng II.4 – Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR với cặp mồi 23S_F – 23S_R .............. 34

Bảng III.1. Các vùng gen sử dụng trong phát hiện vi sinh vật gây bệnh ................. 37

Bảng III. 2. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu .................................................. 38

Bảng III.3. Bảng thống kê các mẫu dò sử dụng trong nghiên cứu mẫu dò ............. 39

Bảng III.4. Bảng thông số vật lí của mồi dựa vào phân tích IDT............................ 46

Bảng III.5. Tổng kết kết quả xét nghiệm trên các mẫu bệnh phẩm ......................... 79

Trang vi

1 DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Hình I.1 – Hình thái tế bào Bacillus cereus.................................................................... 3

Hình I.2 – Hình thái tế bào Brucella............................................................................... 4

Hình I.3 – Hình thái tế bào C. botulinum ....................................................................... 4

Hình I.4 – Hình thái tế bào C. perfringenes ................................................................... 5

Hình I.5 – Hình thái tế bào E.coli ................................................................................... 6

Hình I.6 – Hình thái tế bào L. monocytogenes............................................................... 8

Hình I.7. Hình thái tế bào Staphylococcus aureus......................................................... 9

Hình I.8. Hình thái tế bào Salmonella .......................................................................... 10

Hình I.9. Hình thái tế bào Shigella ............................................................................... 11

Hình I.10. Hình thái tế bào Vibrio cholera ................................................................... 12

Hình I.11. Hình thái tế bào V. parahaelyticus.............................................................. 13

Hình I.12. Hình thái tế bào Y. enterocolitica ................................................................ 14

Hình II.1. Các bước trong một chu kỳ PCR. ................................................................. 2

Hình II.2. Minh họa phương pháp RDB...................................................................... 26

Hình III.1 – Kết quả Blast mồi 16S_F .......................................................................... 41

Hình III.2 – Kết quả Blast mồi 16S_R.......................................................................... 42

Hình III.3 – Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của cặp mồi 16S_F – 16S_R bằng

công cụ Annhyb. ............................................................................................................. 43

Hình III.4 – Kết quả Blast mồi 23S_R.......................................................................... 44

Hình III.5. – Kết quả Blast mồi 23S_R......................................................................... 44

Hình III.6. – Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của cặp mồi 16S_F – 16S_R

bằng công cụ Annhyb..................................................................................................... 46

Hình III.7. – Kết quả Blast mẫu dò BAC..................................................................... 47

Hình III.8. – Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của mẫu dò BAC bằng công cụ

Annhyb. ........................................................................................................................... 48

Hình III.9. – Kết quả Blast mẫu dò BRU..................................................................... 49

Hình III.10. – Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của mẫu dò BAC bằng công cụ

Annhyb. ........................................................................................................................... 50

Hình III.11. – Kết quả Blast mẫu dò CBO................................................................... 51

Trang vii

Hình III.12. – Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của mẫu dò CBO bằng công cụ

Annhyb. ........................................................................................................................... 52

Hình III.13. – Kết quả Blast mẫu dò CPF.................................................................... 53

Hình III.14. – Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của mẫu dò CPF bằng công cụ

Annhyb ............................................................................................................................ 54

Hình III.15. – Kết quả Blast mẫu dò LIS..................................................................... 55

Hình III.16. – Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của mẫu dò LIS bằng công cụ

Annhyb. ........................................................................................................................... 56

Hình III.17. – Kết quả Blast mẫu dò SAL.................................................................... 57

Hình III.18. – Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của mẫu dò SAL bằng công cụ

Annhyb. ........................................................................................................................... 57

Hình III.19. – Kết quả Blast mẫu dò SHI..................................................................... 58

Hình III.20. – Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của mẫu dò SHI bằng công cụ

Annhyb. ........................................................................................................................... 59

Hình III.21. – Kết quả Blast mẫu dò SAU ................................................................... 60

Hình III.22. – Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của mẫu dò SAU bằng công cụ

Annhyb. ........................................................................................................................... 61

Hình III.23. – Kết quả Blast mẫu dò VPA ................................................................... 62

Hình III.24. – Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của mẫu dò VPA bằng công cụ

Annhyb. ........................................................................................................................... 63

Hình III.25. – Kết quả Blast mẫu dò VCH................................................................... 64

Hình III.26. – Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của mẫu dò VCH bằng công cụ

Annhyb. ........................................................................................................................... 65

Hình III.27. – Kết quả Blast mẫu dò YER................................................................... 66

Hình III.28. – Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của mẫu dò YER bằng công cụ

Annhyb. ........................................................................................................................... 67

Hình III.29. – Kết quả Blast mẫu dò ECO................................................................... 68

Hình III.30. – Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của mẫu dò ECO bằng công cụ

Annhyb. ........................................................................................................................... 69

Hình III.31. Màng lai với 12 chấm mẫu dò đã được gắn thành công....................... 70

Trang viii

Hình III.31. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhằm khảo sát sự hoạt động của cặp

mồi 16S, 23S ................................................................................................................... 71

Hình III.32. Kết quả điện di khảo sát nhiệt độ lai của cặp mồi 16S_F – 16S_R ..... 72

Hình III.34. Kết quả PCR-RDB giữa sản phẩm PCR từ DNA vi khuẩn

Staphylococcus aureus với 12 mẫu dò ......................................................................... 73

Hình III.37. Kết quả PCR-RDB giữa sản phẩm PCR từ DNA vi khuẩn

Staphylococcus au reus với 12 mẫu dò trong điều kiện lai có thay đổi .................... 74

Hình III.38. Kết quả PCR-RDB đối với DNA một số loài vi khuẩn gây bệnh

đường ruột...................................................................................................................... 75

Hình III.40. Kết quả điện di sản phẩm PCR các mẫu hỗn hợp 4 loài vi khuẩn 76

Hình III.40. Kết quả lai RDB trên mẫu hỗn hợp 4 loài vi khuẩn ............................. 76

Hình III.41. Kết quả điện di sản phẩm PCR (cặp mồi 16S) trên một số mẫu bệnh

phẩm đại diện................................................................................................................. 78

Hình III.42. Kết quả điện di sản phẩm PCR (cặp mồi 23S) trên mẫu bệnh phẩm

số 10 ................................................................................................................................ 78

Hình III.43. Kết quả lai RDB trên mẫu bệnh phẩm số 3 ........................................... 79

Hình III.44. Kết quả giải trình tự mẫu số 3 với mồi 16S_F....................................... 81

Hình III.45. Kết quả Blast trình tự mẫu bệnh phẩm số 3 ......................................... 82

Hình III.46. Kết quả giải trình tự mẫu số 10 với mồi 23S_F..................................... 83

Trang ix

1 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Kí hiệu viết tắt Diễn giải

A Adenine

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

BP Baird Parker

Bp Base Pair

C Cytosine

cAMP Cyclic Andenosine monophosphate

cDNA complementary DNA

CFU Colony Forming Unit

DNA Deoxyribonucleic acid

EIEC Enteroinvasive E.coli

EPEC Enteropathogenic E.coli

ETEC Enterotoxigenic E.coli

G Guanidine

IDT Integrated DNA technologies

IMViC Indole, Methyl Red, Voges Proskauer, Citrate

ISA Iso-sensitest agar

ITS Internal Transcribed Spacer

LB Labile heat

MR Methyl Red

mRNA messenger RNA

NCBI National Center for Biotechnology Information

OD Optical density

PCR Polymerase Chain Reaction

pH Potential Hydrogen

RDB Reverse dot blot

rDNA Ribosomal Deoxyribonucleic Acid

RNA Ribonucleic acid

Trang x

rRNA ribosomal Ribonucleic Acid

S Semi-conserved

SNP Single nucleotide polymorphism

ST Stable heat

T Thymin

Ta Temperature annealing

TLTK Tài liệu tham khảo

Tm Temperature melting

TMB 3,3,5,5- tetramethylbenzidine

tRNA Transfer Ribonucleic Acid

U Universal

UV Ultraviolet, tia tử ngoại

V Variable

VP Voges Proskauer

VTEC Verotoxigenic E.coli