Biểu hiện và tinh sạch amidase aliphatic từ Rhodococcus erythropolis PR4

Nguyễn Hà Thu và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 184(08): 35 - 40

35

BIỂU HIỆN VÀ TINH SẠCH AMIDASE ALIPHATIC

TỪ Rhodococcus erythropolis PR4

Nguyễn Hà Thu1*

, Nguyễn Xuân Vũ1

, Phạm Bằng Phương1,2

1

Trường Đại học Nông Lâm – ĐH Thái Nguyên

2Viện Khoa học Sự sống – ĐH Thái Nguyên

TÓM TẮT

Để phục vụ mục đích nghiên cứu mức độ biểu hiện trong vi khuẩn E. coli BL21 DE3 của gen mã

hóa amidase khuếch đại từ DNA hệ gen của vi khuẩn Rhodococcus erythropolis PR4, chúng tôi đã

tiến hành biểu hiện và tinh sạch amidase tái tổ hợp trong vi khuẩn E. coli chủng BL21 DE3.

Protein - enzyme amidase ở vi khuẩn này được mã hóa nhờ đoạn gen có kích thước 1038 bp đã

được giải trình tự và công bố trên ngân hàng gen với số hiệu ACNO01000111. Sau khi thiết kế

mồi và khuếch đại thành công đoạn gen, chúng tôi tiến hành tách dòng trên E. coli DH5α và biểu

hiện trên E. coli BL21 DE3 thông qua 2 loại vector tương ứng là pGEM-T và pET28a. Enzyme

amidase có kích thước xấp xỉ 38 kDa được biểu hiện tối ưu ở điều kiện nuôi cấy 37oC, nồng độ

chất cảm ứng IPTG 1 mM trong thời gian 4 h. Sử dụng cột sắc ký trao đổi ion Macro-Prep High Q

(BIO-RAD) và cột superdexTM 200 10/300 (GE Healthcare), chúng tôi đã tinh sạch được amidase

tái tổ hợp từ dịch chiết tế bào.

Từ khóa: Amidase; Escherichia coli; Acrylamide; Enzyme tái tổ hợp; Vector biểu hiện

MỞ ĐẦU*

Amidase (EC 3.5.1.4) được tìm thấy bởi

Mohamed S. và cộng sự vào năm 1994, có

kích thước xấp xỉ 44,5 kDa (xác định bằng

SDS-PAGE) và điểm đẳng điện được ước

tính là pH 4.0. Trình tự aa N-terminal của

enzyme này được công bố như sau: M R H G

D I T S S P D T V G V A V [7].

Amidase được biết đến là enzyme xúc tác quá

trình thủy phân amit giải phóng các axit và

amoniac tương ứng [6]. Enzyme này có thể

được phân thành hai loại theo đặc tính bề mặt

của chúng [2], loại thứ nhất bao gồm các

amidase chỉ làm thuỷ phân các amit mạch

ngắn, loại thứ hai là các amidase thủy phân

chuỗi amit mạch trung bình, acrylamide và

heterocyclicamide như isobutyramide và

valeroamide [3]. Đến nay, đã có hơn 26 loại

amidase có nguồn gốc từ vi khuẩn được sàng

lọc và xác định [5]. Hầu hết trong đó, amidase

tồn tại ở loại thứ hai.

Amidase được ghi nhận là có mặt thường

xuyên ở chi Rhodococcus. Theo nghiên cứu

gần đây của Z. Xue và cs (2011) [6], amidase

tái tổ hợp có nguồn gốc từ vi khuẩn

*

Tel:01643 326153, Email: [email protected]

Rhodococcus erythropolis, một loài vi khuẩn

đặc trưng thuộc nhóm Actinobacteria có khả

năng biểu hiện đầy đủ hoạt tính của amidase

đặc biệt là khả năng tổng hợp chọn lọc bất đối

xứng hiệu quả với một phổ rộng các amit (nổi

bật là một số chất gây độc cho tế bào như

acetamide, propionamide, acrylamide, và

benzamide). Đồng thời trong vi khuẩn này,

gen mã hóa amidase có kích thước 1038 bp

đã được giải trình tự một cách đầy đủ và

công bố trên ngân hàng gen với số hiệu

ACNO01000111 từ nucleotide số 543918

đến nucleotide 544955 [7].

Amidase là loại enzyme thương mại có nhiều

ứng dụng quan trọng trong các ngành công

nghiệp, cụ thể là trong các quy trình liên quan

đến quản lý và xử lý chất thải có chứa

acrylamide, mặt khác sau khi thủy phân,

amidase tạo ra một số axit cacboxylic và dẫn

xuất amit có nhiều ý nghĩa quan trọng ứng

dụng trong nhiều lĩnh vực như công nghiệp

dược phẩm [4].

Do có nhiều tiềm năng quan trọng trong các

ngành công nghiệp, amidase đã được đầu tư

nghiên cứu rộng rãi ngay từ khi được phát

hiện. Nhưng khi nhu cầu ứng dụng trong công

nghiệp ngày càng tăng cao thì cần có nhiều