Xác định trình tự gen E6 và L1 của HPV và gen EBNA-1 của EBV để ứng dụng trong chuẩn đoán ung thư cổ tử cung và vòm mũi họng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

-------------------------

HOÀNG VĂN MẠNH

XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN E6 VÀ L1 CỦA HPV VÀ GEN

EBNA-1 CỦA EBV ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG CHUẨN ĐOÁN UNG

THƯ CỔ TỬ CUNG VÀ VÒM MŨI HỌNG

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 60.42.80

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

PGS.TS. Lê Thanh Hoà

Thái Nguyên - 2011

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ala Alanine

bp Base pair

BL Burkitt’s Lymphoma

CTC Cổ tử cung

E Early region

EBV Epstein-Barr Virus

Gly Glycine

gs-PCR Group-specific PCR

HPV Human papilloma virus

HP6 Hải Phòng 6 (ký hiệu mẫu)

L Late region

LCL Lymphoblastoid

LCR Long control region

LMP Latent membrane protein

MHC Major Histocompatibility Complex

MT7 Miền trung 7 (ký hiệu mẫu)

NPC Nasopharyngeal carcinoma

p53 Protein 53

PV Papilloma virus

RB Retinoblast

TR Terminal repeat

ts-PCR Type- specific PCR

UICC Universal Integrated Circuit Card

UTBM Carcinoma

VCA Viral capsid antigen

VMH Vòm mũi họng

WHO World Health Organization

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng Tên bảng trong luận văn Trang

Bảng 1.1 Tình hình ung thư CTC trên thế giới (không tính Châu

Phi) 5

Bảng 2.1 Thành phần và số lượng từng thành phần tham gia phản

ứng multiplex-PCR HPV-16/HPV-18 38

Bảng 2.2 Chu trình nhiệt độ trong phản ứng multiplex-PCR

HPV16/HPV18 39

Bảng 2.3 Thành phần và số lượng từng thành phần tham gia phản

ứng PCR gen E6 cua HPV-16 39

Bảng 2.4 Chu trình nhiệt độ trong phản ứng PCR của gen EBNA-1 40

Bảng 2.5 Thành phần phản ứng nối sản phẩm PCR vào vector tách

dòng (pCR2.1TOPO)

43

Bảng 2.6 Thành phần của phản ứng cắt plasmid tái tổ hợp bằng

enzym EcoRI 47

Bảng 2.7 Thành phần phản ứng tạo DNA sợi đơn 49

Bảng 2.8 Chu trình nhiệt củ a phản ứng giải trình tự 49

Bảng 3.1 Kết quả truy cập Ngân hàng gen sử dụng chuỗi gen E6

của mẫu PK12 56

Bảng 3.2 Kết quả truy cập Ngân hàng gen sử dụng chuỗi gen L1

của mẫu PS16 57

Bảng 3.3 Kết quả truy cập Ngân hàng gen sử dụng chuỗi

nucleotide gen EBNA-1 của EB17, EB18, EB19 và EB20 64

Bảng 3.4 Kết quả xác định phân týp của các chủng EBV qua phân

tích acid amin tại vị trí 487 của EBNA-1

66

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình Tên hình trong luận văn Trang

Hình 1.1 Bản đồ phân bố dịch tễ theo độ tuổi của người có khả

năng nhiễm ung thư cổ tử cung của các châu lục 4

Hình 1.2 Cơ chế nhiễm HPV (Human papilloma virus) trong ung thư

cổ tử cung 9

Hình 1.3 Mối quan hệ phả hệ và nguồn gốc của 101 Papillomavirus

dựa trên so sánh chuỗi nucleotid của gene capsid L1 11

Hình 1.4 Human Papillomavirus chụp dưới kính hiển vi điện tử 12

Hình 1.5 Cấu trúc phân tử của hệ gene HPV -16. 13

Hình 1.6 Quá trình nhân lên của HPV 15

Hình 1.7 Sơ đồ minh họa quá trình tiến triển của EBV trong cơ thể bị

nhiễm 27

Hình 1.8 Cấu trúc hệ gene EBV dạng khép lại thành mạch vòng (a)

và dạng mạch thẳng (b) 29

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình nghiên cứu phân tích gene EBNA-1 của

virus EBV và E6 của virus HPV16 và L1 của HPV18 34

Hình 2.2 Cấu trúc vector pCR2.1-TOPO® (Invitrogen) 43

Hình 3.1 Kết quả kiểm tra DNA tổng số từ mẫu bệnh phẩm 51

Hình 3.2

Kiểm tra sản phẩm multiplex-PCR sử dụng cùng lúc 2 cặp

mồi (E6F-E6R và HP18F-HP18R) với khuôn DNA tổng

số của các mẫu PS16, PK12, PK11, PK10.

52

Hình 3.3 Kiểm tra sản phẩm tách dòng đoạn gen E6 của mẫu PK12

(bản A) và đoạn gen L1 của mẫu PS16 (bản B). 53

Hình 3.4 Hình ảnh giản đồ (chromatogram) một phần trình tự gen

E6 của mẫu PK12 (HPV-16). 54

Hình 3.5 Hình ảnh giản đồ (chromatogram) một phần trình tự gen

L1 của mẫu PS16 (HPV18). 54

Hình 3.6 Trình bày chuỗi gen E6 của typ HPV-16. 55

Hình 3.7 Trình bày chuỗi gen L1 của typ HPV-18 55

Hình 3.8 Kết quả bước đầu phát hiện HPV16/HPV18 bằng phương

pháp đa mồi multiplex-PCR. 59

Hình 3.9 Kết quả kiểm tra DNA tổng số từ mẫu bệnh phẩm EBV 61

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Hình 3.10 Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di gen EBNA-1 61

Hình 3.11 Hình ảnh giản đồ (chromatogram) một phần trình tự gen

EBNA-1

63

Hình 3.12

Kết quả chuỗi gen EBNA-1 của EB17 được thu nhận sau giải

trình tự 63

Hình 3.13

So sánh một phần trình tự acid amin EBNA-1 của 13 chủng

nghiên cứu 65

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

MỤC LỤC Trang

Trang phụ bìa

Lời cam đoan

Mục lục

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình

ĐẶT VẤN ĐỀ.........................................................................................................1.

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU....................................................................4

1.1. UNG THƢ CỔ TỬ CUNG VÀ HUMAN PAPILLOMA VIRUS (HPV).... 4

1.1.1 Dịch tễ học ung thư cổ tử cung.............................................................4

1.1.1.1. Trên thế giới............................................................................4..

1.1.1.2. Tình hình ung thư cổ tử cung ở Việt Nam................................ 6

1.1.1.3. Các yếu tố có nguy cơ đối với ung thư CTC............................ 6

1.1.1.4. Human papilloma virus và bệnh ung thư cổ tử cung................ 6

1.1.2. Phân loại và đặc tính sinh học của Papilloma virus............................... 9

1.1.2.1. Phân loại Papilloma virus.......................................................9..

1.1.2.2. Đặc tính sinh học của Human Papillomavirus.......................1..2

1.1.2.3. Quá trình nhân lên của HPV..................................................... 14

1.1.2.4. Cơ chế gây ung thư cổ tử cung của HPV................................1..6

1.1.3. Chẩn đoán ung thư CTC.......................................................................1.7

1.1.3.1. Chẩn đoán tế bào học................................................................ 17

1.1.3.2. Chẩn đoán dựa trên phân tích mRNA....................................... 19

1.1.3.3. Định týp HPV bằng sinh học phân tử.....................................19..

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

1.1.4. Tầm quan trọng của việc nghiên cứu sinh học phân tử và xây dựng

phương pháp PCR chẩn đoán nhanh HPV gây ung thư cổ tử cung ở Việt Nam........ 21

1.2. UNG THƢ VÒM MŨI HỌNG VÀ EPSTEIN-BARR VIRUS (EBV)....... 22

1.2.1. Dịch tễ học ung thư vòm mũi họng.......................................................2.2

1.2.1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới............................................ 22

1.2.1.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam........................................... 23

1.2.2. Đặc tính sinh học của Epstein-Bar virus (EBV)..................................... 24

1.2.2.1. Phát hiện virus Epstein - Barr và ung thư VMH...................2...4

1.2.2.2. Đặc điểm phân loại và cấu trúc EBV........................................ 25

1.2.2.3. Sự nhân lên, tàng nhiễm và khả năng gây ung thư của

EBV…....................................................................................26

1.2.2.4. Sinh học phân tử và sắp xếp hệ gene của EBV......................2...8

1.2.2.5. Gene và sản phẩm của gene EBNA-1....................................... 29

1.2.3. Tầm quan trọng của việc nghiên cứu sinh học phân tử và xây dựng

phương pháp PCR chẩn đoán sớm EBV ung thư vòm mũi họng ở Việt Nam........... 30

CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................... 33

2.1. Đối tƣợng nghiên cứu........................................................................................3.3

2.2. Dụng cụ, trang thiết bị nghiên cứu và hoá chất nghiên cứu .......................... 33

2.2.1. Dụng cụ, trang thiết bị..........................................................................33

2.2.2. Hoá chất...............................................................................................3. 3

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu................................................................................... 34

2.4. Quy trình nghiên cứu.......................................................................................... 35

2.4.1. Lấy mẫu và bảo quản............................................................................. 35

2.4.2. Kỹ thuật tách chiết DNA tổng số............................................................ 35

2.4.3. Quy trình phản ứng PCR và kiểm tra sản phẩm PCR............................. 37

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

2.4.3.1. Thiết kế mồi………………………………………………. 37

2.4.3.2. Quy trình phản ứng PCR.......................................................... 38

2.4.3.3. Kỹ thuật phát hiện sản phẩm PCR............................................ 40

2.4.3.4. Tinh sạch sản phẩm PCR.......................................................... 41

2.4.4. Phương pháp tạo dòng sản phẩm PCR.................................................... 42

2.4.4.1. Tạo vectơ tái tổ hợp.................................................................. 42

2.4.4.2. Chuyển nạp……………………………………..……………43

2.4.4.3. Chọn lọc vi khuẩn tái tổ hợp..................................................... 44

2.4.4.4. Tách DNA plasmid tái tổ hợp................................................... 45

2.4.4.5. Kiểm tra DNA tái tổ hợp........................................................4..7

2.4.5. Giải trình trình tự và xử lý số liệu........................................................... 48

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.......................................................... 51

3.1. Kết quả thu nhận, giải trình trình tự và xác định gen E6 của HPV-16

và L1 của HPV-18....................................................................................................51

3.1.1. Kết quả kiểm tra DNA tổng số từ mẫu bệnh phẩm.............................51

3.1.2. Kết quả thực hiện phản ứng Multiplex-PCR phát hiện HPV-16 và

HPV-18..................................................................................................... 52

3.1.3. Kết quả tách dòng và giải trình tự các sản phẩm HPV-16 và

HPV-18 từ các mẫu kiểm tra..................................................................53

3.1.4. Kết quả giải trình tự và thu nhận chuỗi gen E6 của HPV-16 và

chuỗi gen L1 của HPV-18................................................................. 54

3.1.5. Kết quả truy cập Ngân hàng gen xác định chuỗi gen E6 của

HPV16 và L1 của HPV18......................................................................56

3.1.6. Kết quả bước đầu phát hiện HPV-16 và HPV-18 bằng phương

pháp đa mồi multiplex-PCR..................................................................... 59