Xác định nhóm vi khuẩn gây bệnh đường ruột bằng phương pháp PCR - REVERSE DOT BLOT

TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN

THAM GIA XÉT GIẢI THƢỞNG NGHIÊN CỨU CẤP TRƢỜNG

XÁC ĐỊNH NHÓM VI KHUẨN GÂY BỆNH

ĐƢỜNG RUỘT BẰNG PHƢƠNG PHÁP PCR -

REVERSE DOT BLOT

Mã số đề tài

Thuộc nhóm ngành khoa học:

VI SINH –SINH HỌC PHÂN TỬ ỨNG DỤNG TRONG Y DƢỢC

TP.HCM, 04/2013

TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN

THAM GIA XÉT GIẢI THƢỞNG NGHIÊN CỨU CẤP TRƢỜNG

XÁC ĐỊNH NHÓM VI KHUẨN GÂY BỆNH ĐƢỜNG RUỘT

BẰNG PHƢƠNG PHÁP PCR -REVERSE DOT BLOT

Mã số đề tài

Thuộc nhóm ngành khoa học:

VI SINH –SINH HỌC PHÂN TỬ ỨNG DỤNG TRONG Y DƢỢC

Sinh viên thực hiện: TRẦN THỊ PHÚC Nam, Nữ: Nữ

Dân tộc: Kinh

Lớp, khoa: Khóa 09-Khoa CNSH Năm thứ: 4 /Số năm đào tạo:4

Ngành học: Chuyên ngành Vi sinh-Sinh học phân tử

Ngƣời hƣớng dẫn:PGS.TS. LÊ HUYỀN ÁI THÚY

ThS. TRƢƠNG KIM PHƢỢNG

-i￾MỤC LỤC

DANH MỤC HÌNH ........................................................................................................v

DANH MỤC BẢNG BIỂU............................................................................................ix

DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT .......................................................................x

MỞ ĐẦU .........................................................................................................................1

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................3

I.1. TÌNH HÌNH NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT

NAM: ...........................................................................................................................3

I.1.1. Trên thế giới:...............................................................................................3

I.1.2. Ở Việt Nam: ................................................................................................4

I.2. CÁC NHÓM VI KHUẨN GÂY BỆNH THƢỜNG GẶP: ...............................4

I.2.1. Bacillus cereus ............................................................................................4

I.2.1.1. Đặc điểm hình thái...................................................................................4

I.2.1.2. Đặc điểm sinh hóa và sinh dƣỡng............................................................4

I.2.1.3. Thông tin bộ máy di truyền

[101]

................................................................5

I.2.1.4. Đặc điểm gây độc và gây bệnh của Bacillus cereus:

[81]

..........................5

I.2.2. Clostridium botulinum ................................................................................5

I.2.2.1. Đặc điểm hình thái[81]

..............................................................................5

I.2.2.2. Đặc điểm sinh hóa và sinh dƣỡng............................................................6

I.2.2.3. Thông tin bộ máy di truyền

[101]

................................................................7

I.2.2.4 Đặc điểm gây độc và gây bệnh của C.botulinum[81]

..................................7

I.2.3. Clostridium perfringens..............................................................................7

I.2.3.1. Đặc điểm hình thái[81]

..............................................................................7

I.2.3.2. Đặc điểm sinh hóa và sinh dƣỡng............................................................7

I.2.3.3. Thông tin bộ máy di truyền

[101]

................................................................8

I.2.3.4. Đặc điểm gây độc và gây bệnh của C. perfringens[81]

.............................8

I.2.4. Staphylococcus aureus................................................................................8

I.2.4.1. Đặc điểm hình thái[81]

..............................................................................8

I.2.4.2. Đặc điểm sinh hóa và sinh dƣỡng............................................................8

I.2.4.3. Thông tin bộ máy di truyền

[101]

................................................................9

I.2.4.4. Đặc điểm gây độc và gây bệnh của Staphylococcus aureus[84]

...............9

I.2.5. Listeria monocytogenes...............................................................................9

-ii￾I.2.5.1. Đặc điểm hình thái[81]

..............................................................................9

I.2.5.2. Đặc điểm sinh hóa và sinh dƣỡng............................................................9

I.2.5.3. Thông tin bộ máy di truyền

[101]

.............................................................10

I.2.5.4. Cơ chế gây độc và gây bệnh của L. monocytogenes[81]

.........................10

I.2.6. Escherichia coli O157:H7.........................................................................10

I.2.6.1. Đặc điểm hình thái.................................................................................10

I.2.6.2. Đặc điểm sinh hóa và sinh dƣỡng..........................................................10

I.2.6.3. Thông tin bộ máy di truyền

[101]

..............................................................11

I.2.6.4. Đặc điểm gây độc và gây bệnh của Escherichia coli O157:H7 ............11

I.2.7. Salmonella spp. .........................................................................................12

I.2.7.1. Đặc điểm hình thái.................................................................................12

I.2.7.2. Đặc điểm môi trƣờng sống ....................................................................12

I.2.7.3. Đặc điểm sinh hóa và sinh dƣỡng..........................................................13

I.2.7.4. Thông tin bộ máy di truyền

[101]

..............................................................13

I.2.7.5. Độc tố của Salmonella spp. ...................................................................13

I.2.8. Shigella spp. ..............................................................................................13

I.2.8.1. Đặc điểm hình thái.................................................................................13

I.2.8.2. Đặc điểm sinh hóa và sinh dƣớng..........................................................14

I.2.8.3. Thông tin bộ máy di truyền

[101]

.............................................................14

I.2.8.4. Độc tố của Shigella spp. ........................................................................14

I.2.9. Yersinia enterocolitica ..............................................................................14

I.2.9.1. Đặc điểm hình thái.................................................................................14

I.2.9.2. Đặc điểm sinh hóa và sinh dƣỡng..........................................................15

I.2.9.3. Thông tin bộ máy di truyền

[101]

..............................................................15

I.2.9.4. Cơ chế gây độc và gây bệnh của Yersinia enterocolitica.....................15

I.2.10. Vibrio cholerae..........................................................................................15

I.2.10.1. Đặc điểm hình thái[81]

.........................................................................15

I.2.10.2. Đặc điểm sinh hóa và sinh dƣỡng ......................................................15

I.2.10.3. Thông tin bộ máy di truyền

[101]

..........................................................16

I.2.10.4. Cơ chế gây độc và gây bệnh của Vibrio cholerae[81]

..........................16

I.2.11. Vibrio parahaemolyticus...........................................................................16

I.2.11.1. Đặc điểm hình thái[81]

.........................................................................16

I.2.11.2. Đặc điểm sinh hóa và sinh dƣỡng ......................................................16

-iii￾I.2.11.3. Thông tin bộ máy di truyền

[101]

..........................................................16

I.2.11.4. Độc tố của Vibrio parahaemolyticus[81]

.............................................17

I.2.12. Brucella spp. .............................................................................................17

I.2.12.1. Đặc điểm hình thái .............................................................................17

I.2.12.2. Đặc điểm sinh hóa và sinh dƣỡng ......................................................17

I.2.12.3. Thông tin bộ máy di truyền

[101]

..........................................................17

I.2.12.4. Đặc điểm gây độc và gây bệnh của Brucella spp...............................17

I.3. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VI SINH VẬT .....................................17

I.3.1. Phƣơng pháp truyền thống ........................................................................18

I.3.2. Phƣơng pháp phân tử hiện đại phát hiện vi sinh vật gây bệnh .................19

I.3.2.1. Phƣơng pháp PCR..................................................................................19

a. Định nghĩa.................................................................................................19

b. Các thành phần trong phản ứng PCR.......................................................20

c. Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp PCR.......................................22

I.3.2.2. Multiplex PCR:......................................................................................23

I.3.2.3. Phƣơng pháp ELISA (Enzym Linked Immunosorbent Assay) .............23

I.3.2.4. Phƣơng pháp microarray........................................................................24

I.3.2.5. Phƣơng pháp Reverse dot blot...............................................................25

I.4. VÙNG TRÌNH TỰ 16S và 23S rDNA............................................................26

I.4.1. Vùng gen 16S rRNA..............................................................................26

I.4.2. Vùng gen 23S rRNA..............................................................................28

I.5. NHỮNG CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU VỀ VIỆC PHÁT HIỆN CÁC VI

SINH VẬT GÂY BỆNH BẰNG CÔNG CỤ SINH HỌC PHÂN TỬ......................28

PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ................................................................30

II.1 VẬT LIỆU...........................................................................................................30

II.1.1. Các công cụ tin sinh học: ..........................................................................30

II.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................................................................30

II.2.1 Khai thác dữ liệu bài báo khoa học...............................................................30

II.2.2 Thu nhận các trình tự gen 16, 23S rDNA của 12 vi khuẩn mục tiêu:...........30

II.2.3 Thiết kế mồi và mẫu dò.................................................................................32

PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.....................................................................33

III.1. KẾT QUẢ KHAI THÁC DỮ LIỆU.............................................................33

III.2. KHẢO SÁT IN SILICO...............................................................................35

-iv￾III.2.1 Tìm hiểu và đánh giá các hệ mồi cho phản ứng PCR..................................35

III.2.2 Tìm hiểu và đánh giá các hệ mẫu dò cho phản ứng RDB ...........................39

III.2.2. 1. Kết quả khảo sát hệ mẫu dò của Bacillus cereus ...............................41

III.2.2. 2. Kết quả khảo sát hệ mẫu dò CB1 của Clostridium botulinum ...........43

III.2.2. 3. Kết quả khảo sát hệ mẫu dò CP1 của Clostridium perfringens .........45

III.2.2. 4. Kết quả khảo sát hệ mẫu dò STA1 của Staphylococcus aureus ........47

III.2.2. 5. Kết quả khảo sát hệ mẫu dò LIS1 của Listeria monocytogenes.........49

III.2.2. 6. Kết quả khảo sát hệ mẫu dò của Escherichia coli O157:H7..............51

III.2.2. 7. Kết quả khảo sát hệ mẫu dò SAL1 của Salmonella spp.....................55

III.2.2. 8. Kết quả khảo sát hệ mẫu dò SHI1 của Shigella spp...........................57

III.2.2. 9. Kết quả khảo sát hệ mẫu dò VCH1 của Vibrio cholerae ...................59

III.2.2. 10. Kết quả khảo sát hệ mẫu dò VPA1 của Vibrio parahaemolyticus ...61

III.2.2. 11. Kết quả khảo sát hệ mẫu dò YER1 của Yersinia enterocolitica.......63

III.2.2. 12. Kết quả khảo sát hệ mẫu dò BRU1 của Brucella spp.......................65

III.2.2. 13. Tìm hiểu và đánh giá các mẫu dò phát hiện chứng dƣơng, chứng âm,

chứng màu (color control)...................................................................................67

III.2.2. 14. Tổng hợp các kết quả phân tích, đánh giá thông số vật lý của các mồi

và mẫu dò ...........................................................................................................68

PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.........................................................................70

IV.1 KẾT LUẬN......................................................................................................70

IV.2 ĐỀ NGHỊ .........................................................................................................70

TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................................71

PHỤ LỤC ......................................................................................................................82

-v￾DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1: Bacillus cereus 4

Hình 2: Clostridium botulinum 5

Hình 3: Clostridium perfringens 7

Hình 4: Staphylococcus aureus 8

Hình 5: Listeria monocytogenes 9

Hình 6: E.coli 10

Hình 7: Salmonella spp. 12

Hình 8: Shigella spp. 14

Hình 9: Yersinia enterocolitica 14

Hình 10: Vibrio cholerae 15

Hình11: Vibrio parahaemolyticus 16

Hình 12: Brucella spp. 17

Hình 13: Sơ đồ mô tả phản ứng PCR 22

Hình 14: Minh họa phƣơng pháp RDB 26

Hình 15: Cấu trúc vùng gen 16, 23S rRNA 28

Hình 16. Kết quả chạy Bioedit của mồi 16SF và 12 trình tự 16S rDNA của 12 loài vi

khuẩn mục tiêu 38

Hình 17. Kết quả chạy Bioedit của mồi 16SR và 12 trình tự 16S rDNA của 12 loài vi

khuẩn mục tiêu 38

Hình 18. Kết quả chạy Bioedit của mồi 23SF và 12 trình tự 23S rDNA của 12 loài vi

khuẩn mục tiêu 39

Hình 19. Kết quả chạy Bioedit của mồi 23SR và 12 trình tự 23S rDNA của 12 loài vi

khuẩn mục tiêu 39

-vi￾Hình 20. Kết quả Blast mẫu dò BC1 của Bacillus cereus 41

Hình 21. Kết quả chạy Bioedit mẫu dò BC1 của Bacillus cereus 42

Hình 22. Kết quả sắp gióng cột cặp mồi 16S rDNA và mẫu dò

BC1 của Bacillus cereus với đoạn trình tự 16S rDNA Bacillus cereus có mã số

AY425946.1 42

Hình 23. Kết quả Blast mẫu dò CB1 của C. botulinum 43

Hình 24. Kết quả chạy Bioedit mẫu dò CB1 của C. botulinum 44

Hình 25. Kết quả sắp gióng cột cặp mồi 16S rDNA và mẫu dò CB1

của C. botulinum với đoạn trình tự 16S rDNA

C. botulinum có mã số CP002011.1 44

Hình 26. Kết quả chạy Bioedit mẫu dò CP1 của C. perfringens 45

Hình 27. Kết quả Blast mẫu dò CP2 của C. perfringens 46

Hình 28. Kết quả chạy Bioedit mẫu dò CP2 của C. perfringens 46

Hình 29. Kết quả sắp gióng cột cặp mồi 16S rDNA và mẫu dò

CP2 của C. perfringens với đoạn trình tự 16S rDNA C. perfringens

có mã số AB566417.1 47

Hình 30. Kết quả Blast mẫu dò STA1 của S. aureus 48

Hình 31. Kết quả chạy Bioedit mẫu dò STA1 của S. aureus 48

Hình 32. Kết quả sắp gióng cột cặp mồi 16S rDNA và mẫu dò

STA1 của S. aureus với đoạn trình tự 16S rDNA

S. aureus có mã số CP002643.1 49

Hình 33. Kết quả Blast mẫu dò LIS1 của L. monocytogenes 50

Hình 34. Kết quả chạy Bioedit mẫu dò LIS1 của L. monocytogenes 50

Hình 35. Kết quả sắp gióng cột cặp mồi 16S rDNA và mẫu dò

LIS1 của L. monocytogenes với đoạn trình tự

16S rDNA L. monocytogenes có mã số S55472.1 51

Hình 36. Kết quả chạy Bioedit mẫu dò ECO1 của E. coli O157:H7 52

-vii￾Hình 37. Kết quả Blast mẫu dò ECO2 của E. coli O157:H7 53

Hình 38. Kết quả chạy Bioedit mẫu dò ECO2 của E. coli O157:H7 54

Hình 39. Kết quả sắp gióng cột cặp mồi 23S rDNA và mẫu dò

ECO2 của E. coli O157:H7 với đoạn trình tự

23S rDNA E. coli O157:H7 có mã số NR_076322.1 54

Hình 40. Kết quả Blast mẫu dò SAL1 của Salmonella spp. 55

Hình 41. Kết quả chạy Bioedit mẫu dò SAL1 của Salmonella spp. 56

Hình 42. Kết quả sắp gióng cột cặp mồi 16S rDNA và

mẫu dò SAL1 của Salmonella spp. với đoạn trình

tự 16S rDNA Salmonella spp.có mã số NR_074935.1 56

Hình 43. Kết quả Blast mẫu dò SHI1 của Shigella spp. 57

Hình 44. Kết quả chạy Bioedit mẫu dò SHI1 của Shigella spp. 58

Hình 45. Kết quả sắp gióng cột cặp mồi 16S rDNA và

mẫu dò SHI1 của Shigella spp. với đoạn trình tự

16S rDNA Shigella boydii có mã số NR_074893.1 58

Hình 46. Kết quả Blast mẫu dò VCH1 của V. cholerae 59

Hình 47. Kết quả chạy Bioedit mẫu dò VCH1 củaV. cholerae 60

Hình 48. Kết quả sắp gióng cột cặp mồi 16S rDNA và

mẫu dò VCH1 của V. cholerae với đoạn trình tự

16S rDNA V. cholerae có mã số NR_044050.1 60

Hình 49. Kết quả Blast mẫu dò VPA1 của V. parahaemolitycus 61

Hình 50. Kết quả chạy Bioedit mẫu dò VPA1 của V. Parahaemolitycus 62

Hình 51. Kết quả sắp gióng cột cặp mồi 16S rDNA và

mẫu dò VPA1 của V.parahaemolitycus với đoạn trình tự 16S rDNA

V.parahaemolitycus có mã số NR_074196.1 62

Hình 52. Kết quả Blast mẫu dò YER1 của Y. Enterocolitica 63

-viii￾Hình 53. Kết quả chạy Bioedit mẫu dò YER1 của Y. enterocolitica 64

Hình 54. Kết quả sắp gióng cột cặp mồi 16S rDNA

và mẫu dò YER1 của Y. enterocolitica với đoạn trình tự 16S rDNA

Y. enterocolitica có mã số HQ222845.1 65

Hình 55. Kết quả Blast mẫu dò BRU1 của Brucella spp. 66

Hình 56. Kết quả chạy Bioedit của mẫu dò BRU1 của Brucella spp. 66

Hình 57. Kết quả sắp gióng cột cặp mồi 16S rDNA và

mẫu dò BRU1 của Brucella spp.với đoạn trình tự

16S rDNA Brucella ceti có mã số NR_042463 67

Hình 58. Kết quả chạy Bioedit mẫu dò phát hiện chứng dƣơng CD1 68

Hình 59. Kết quả chạy Bioedit mẫu dò phát hiện chứng âm CA1 68

-ix￾DANH MỤC BẢNG BIỂU

Trang

Bảng 1: Đặc điểm sinh hóa của C.botulinum 6

Bảng 2: Đặc điểm sinh hóa của Salmonella spp. 13

Bảng 3: Các vùng và chức năng của gen 16S rRNA 27

Bảng 4: Thông tin các trình tự gen 16S và 23S rRNA

thu thập trên ngân hàng gen 31

Bảng 5: Mức độ phổ biến của các loại gen trong các nghiên cứu 33

Bảng 6: Các kỹ thuật thƣờng sử dụng để phát hiện vi sinh vật gây bệnh 34

Bảng 7: Trình tự và các thông số vật lý của các cặp mồi 37

Bảng 8. Trình tự của các mẫu dò tham khảo 40

Bảng 9. Trình tự và các thông số đánh giá mồi đƣợc chọn của IDT 68

Bảng 10. Trình tự và các thông số đánh giá mẫu dò đƣợc chọn của IDT 69

-x￾DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

ATVSTP An toàn vệ sinh thực phẩm

BLAST Basic Local Sắp gióng cộtment Search Tool

bp base pair

C Cytosine

cDNA complementary DNA

CFU colony forming unit

DNA Deoxyribonucleic acid

ELISA Enzyme Linked Immunosorbent

FISH Fluorescent in situ hybridization

G Guanidine

NCBI National Center for Biotechnology Information

NĐTP Ngộ độc thực phẩm

nu Nucleotide

PCR Polymerase Chain Reaction

RDB Reverse dot blot

RNA Ribonucleic acid

rRNA Ribosomal RNA

rDNA gen rRNA.

SE Staphylococcal enterotoxin

TLTK Tài liệu tham khảo

Tm Nhiệt độ nóng chảy

UV Ultraviolet, tia tử ngoại

WHO World Health Organization, Tổ chức Y tế thế giới.

-xi￾BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

1. 1. Thông tin chung:

- Sinh viên thực hiện: TRẦN THỊ PHÚC Nam, Nữ: Nữ

- Dân tộc: Kinh

- Lớp, khoa: Khóa 09-Khoa CNSH Năm thứ: 4 /Số năm đào tạo:4

- Ngành học: Chuyên ngành Vi sinh-Sinh học phân tử

- Ngƣời hƣớng dẫn: PGS.TS. LÊ HUYỀN ÁI THÚY

ThS. TRƢƠNG KIM PHƢỢNG

2. Mục tiêu đề tài:

Xây dựng quy trình phát hiện 12 tác nhân vi khuẩn gây bệnh đƣờng ruột bằng kỹ

thuật PCR kết hợp lai phân tử (Reverse dot blot) sử dụng vùng trình tự 16 -23S rDNA,

nhằm tìm ra phƣơng pháp chẩn đoán nhanh, chính xác nhằm góp phần vào công tác

kiểm soát vệ sinh an toàn thực phẩm và phòng chống ngộ độc thực phẩm.

3. Tính mới và sáng tạo:

Các công bố trong nƣớc trƣớc đây về ứng dụng của kỹ thuật Sinh học Phân tử

trong phát hiện vi khuẩn gây bệnh đƣờng ruột chỉ là dựa trên PCR: PCR – điện di,

Real-time PCR, Multiplex-PCR… Đề tài này hƣớng đến một công nghệ khác, đó là sự

kết hợp giữa PCR và lai ngƣợc theo từng lỗ trên màng (PCR-Reverse Dot Blot). Biện

pháp mới này, nếu xây dựng thành công sẽ khắc phục các yếu điểm mà các công bố

trƣớc đây chƣa thể, đó là: khả năng phát hiện đồng thời cùng lúc nhiều vi khuẩn, bởi

chúng tôi không phải tối ƣu hóa các phản ứng PCR đa mồi, mà trong thực tế việc tối

ƣu này là rất khó thực hiện. Ngoài ra, việc ứng dụng công nghệ lai ngƣợc (Reverse),

tức là mẫu dò đƣợc cố định trên màng, còn sản phẩm đích cần lai thì sẽ bổ sung trong

quá trình thực hiện phản ứng lai. Chính vì vậy, công nghệ này sẽ dễ dàng triển khai

ứng dụng trong thực tế bởi ngƣời sử dụng sẽ chỉ thực hiện rất ít các thao tác: bao gồm

tách chiết DNA, PCR và lai (mà không phải cố định vật liệu trên màng) với các mẫu