Xác định cơ sở phân tử của bệnh cao Cholesterol trong máu có tính chất gia đình liên quan đến Gen LDLR (Low Density Lipoprotein Receptor)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP. HỒ CHÍ MINH

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên chuyên đề:

XÁC ĐỊNH CƠ SỞ PHÂN TỬ CỦA BỆNH

CAO CHOLESTEROL TRONG MÁU CÓ

TÍNH CHẤT GIA ĐÌNH LIÊN QUAN ĐẾN

GEN LDLR (LOW DENSITY LIPOPROTEIN

RECEPTOR)

KHOA: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH - SINH HỌC PHÂN TỬ

GVHD: PGS. TS. LÊ HUYỀN ÁI THUÝ

ThS. TRƢƠNG KIM PHƢỢNG

SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC MỸ

MSSV: 1153010494

KHOÁ: 2011 - 2015

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP. HỒ CHÍ MINH

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên chuyên đề:

XÁC ĐỊNH CƠ SỞ PHÂN TỬ CỦA BỆNH

CAO CHOLESTEROL TRONG MÁU CÓ

TÍNH CHẤT GIA ĐÌNH LIÊN QUAN ĐẾN

GEN LDLR (LOW DENSITY LIPOPROTEIN

RECEPTOR)

KHOA: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH - SINH HỌC PHÂN TỬ

GVHD: PGS. TS. LÊ HUYỀN ÁI THUÝ

ThS. TRƢƠNG KIM PHƢỢNG

GVHD ký xác nhận: SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC MỸ

MSSV: 1153010494

KHOÁ: 2011 - 2015

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2015

Chuyên Đề KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC MỸ Trang i

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô trong khoa Công Nghệ Sinh

Học trƣờng Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh và quý thầy cô chuyên ngành Vi

sinh - Sinh học phân tử đã tận tình dạy bảo, truyền đạt cho em những kiến thức,

kinh nghiệm trong suốt thời gian qua.

Em xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Lê Huyền Ái Thuý, ThS. Lao Đức

Thuận - phụ trách, nghiên cứu và làm việc tại phòng thí nghiệm Sinh học phân tử,

các anh chị và các bạn làm khoá luận tại Phòng đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp

đỡ em tận tình trong suốt thời gian khoá luận tốt nghiệp.

Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS. Trƣơng Kim Phƣợng

đã hết lòng giúp đỡ, trực tiếp hƣớng dẫn em trong suốt quá trình làm thực tập tốt

nghiệp. Cô đã chỉ dạy em không chỉ nhiều kiến thức bổ ích mà còn tinh thần làm

việc, thái độ nghiên cứu khoa học nghiêm túc và hiệu quả.

Sau cùng, con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Cha Mẹ và gia đình đã nuôi

dƣỡng, dạy bảo để con có đƣợc ngày hôm nay. Xin cảm ơn anh chị em trong gia

đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ trong quá trình học tập và hoàn thành khoá luận

tốt nghiệp.

Xin Chân Thành Cảm Ơn!

Sinh viên

Nguyễn Thị Ngọc Mỹ

Chuyên Đề KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC MỸ Trang ii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ApoB Apolipoprotein B - 100

ApoE Apolipoprotein E

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

CHD Coronary Heart Disease

CVD Cardiovascular Disease

DGGE Denaturing Gradient Gel Electrophoresis

DNA Deoxyribonucleic Acid

FH Familial Hypercholesterolemia

HDL High Density Lipoprotein

heFH heterozygous Familial Hypercholesterolemia

hoFH homozygous Familial Hypercholesterolemia

LDL Low Density Lipoprotein

LDLR Low Density Lipoprotein Receptor

LDLRAP1 LDLR adaptor protein 1

MLPA Multiplex Ligation – dependent Probe Amplification

NCBI National Center for Biotechnology Information

NIH National Institutes of Health

PCR Polymerase Chain Reaction

PCSK9 Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9

RER Rough Endoplasmic Reticulum

SRE Steroid Response Element

SREBP Steroid Response Element Binding Protein

SSCP Single – Strand Conformation Polymorphism

TC Total Cholesterol

TG Triglyceride

Chuyên Đề KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC MỸ Trang iii

DANH MỤC BẢNG

Bảng II.1. Thành phần phản ứng PCR với bộ mồi LDLR13_F và LDLR13_R.......19

Bảng II.2. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR với bộ mồi LDLR13_F và LDLR13_R

...........................................................................................................................19

Bảng III.1. Số lƣợng công trình nghiên cứu đƣợc thu thập từ PubMed (NCBI) ......21

Bảng III.2. Các công trình nghiên cứu về bệnh FH trên NCBI ................................22

Bảng III.3. Các dạng đột biến điểm trên gen LDLR thu thập đƣợc trên thế giới......23

Bảng III.4. Số dạng đột biến điểm trên gen LDLR ở các châu lục ...........................25

Bảng III.5. Các dạng đột biến điểm trên gen LDLR ở các quốc gia trên thế giới.....26

Bảng III.6. Số dạng đột biến điểm trên các exon gen LDLR ....................................28

Bảng III.7. Cơ sở dữ liệu gen LDLR đƣợc thu thập trên NCBI................................31

Bảng III.8. Các bộ mồi khuếch đại vùng trình tự exon 4..........................................33

Bảng III.9. Thông số chi tiết các cặp mồi khuếch đại exon 4 thu thập đƣợc............34

Bảng III.10. Một số thông số vật lý của bộ mồi........................................................38

Bảng III.11. Giá trị đo mật độ quang của 6 mẫu bệnh phẩm....................................39

Bảng III.12. Tổng hợp kết quả gải trình tự exon 4 gen LDLR..................................50

Bảng VI.1. Số lƣợng đột biến trên exon của gen LDLR ...........................................64

Bảng VI.2. Kết quả đánh giá độ đặc hiệu của bộ mồi LDLR13 bằng Annhyb…….78

Bảng VI.3. Thông số của các mẫu bệnh phẩm thu thập đƣợc……………………...79

Chuyên Đề KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC MỸ Trang iv

DANH MỤC HÌNH

Hình I.1. Con đƣờng chuyển hóa của thụ thể LDL [27].............................................4

Hình I.2. Xơ vữa động mạch [75]...............................................................................5

Hình I.3. Một số biểu hiện ở bệnh nhân FH [57]........................................................8

Hình I.4. Vị trí gen LDLR trên nhiễm sắc thể số 19 (Genecards)...............................9

Hình I.5. Các vùng chức năng của thụ thể LDL [7]..................................................10

Hình III.1. Tỉ lệ đột biến gen LDLR trên exon 4.......................................................29

Hình III.2. Biểu đồ thể hiện các phƣơng pháp xác định đột biến trên gen LDLR ....30

Hình III.3. Đánh giá độ tƣơng đồng của trình tự gen LDLR bằng công cụ Bioedit .32

Hình III.4. Khảo sát độ đặc hiệu của mồi LDLR13_F bằng công cụ BLAST..........36

Hình III.5. Khảo sát độ đặc hiệu của mồi LDLR13_R bằng công cụ BLAST.........37

Hình III.6. Xác định vị trí bắt cặp của mồi LDLR13_F và LDLR13_R bằng công cụ

Annhyb...............................................................................................................37

Hình III.7. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại gen LDLR với bộ mồi LDLR13_F

và LDLR13_R....................................................................................................40

Hình III.8. Kết quả điện di khuếch đại gen LDLR với bộ mồi LDLR13_F và

LDLR13_R ........................................................................................................40

Hình III.9. Kết quả khảo sát mức độ tƣơng đồng trình tự A2F bằng công cụ BLAST

...........................................................................................................................44

Hình III.10. Một số vị trí nghi ngờ xuất hiện đột biến điểm trên trình tự A2F ........44

Hình III.11. Kết quả khảo sát mức độ tƣơng đồng trình tự A6F bằng công cụ

BLAST...............................................................................................................45

Hình III.12. Sắp gióng cột trình tự A6F với NM_000527.4 bằng công cụ BioEdit .45

Hình III.13. Kết quả khảo sát mức độ tƣơng đồng trình tự A7F bằng công cụ

BLAST...............................................................................................................46

Hình III.14. Sắp gióng cột trình tự A7F với NM_000527.4 bằng công cụ BioEdit .46

Hình III.15. Kết quả khảo sát mức độ tƣơng đồng trình tự A1F bằng công cụ

BLAST...............................................................................................................47

Hình III.16. Một số vị trí xuất hiện đột biến điểm trên trình tự A1F........................47

Chuyên Đề KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

SVTH: NGUYỄN THỊ NGỌC MỸ Trang v

Hình III.17. Kết quả khảo sát mức độ tƣơng đồng trình tự A3F bằng công cụ

BLAST...............................................................................................................48

Hình III.18. Một số vị trí xuất hiện đột biến điểm trên trình tự A3F........................48

Hình III.19. Kết quả khảo sát mức độ tƣơng đồng trình tự A4F bằng công cụ

BLAST...............................................................................................................49

Hình III.20. Một số vị trí xuất hiện đột biến điểm trên trình tự A4F........................49

Hình VI.1. Tỉ lệ đột biến trên exon của gen LDLR [49] ...........................................64

Hình VI.2. Mức độ tƣơng đồng của trình tự NG_009060 và NM_000527.4 ...........65

Hình VI.3. Kết quả khảo sát độ tƣơng đồng của trình tự NG_009060.1 bằng công cụ

BLAST...............................................................................................................65

Hình VI.4. Kết quả khảo sát độ tƣơng đồng của trình tự NM_000527.4 bằng công

cụ BLAST..........................................................................................................66

Hình VI.5. Đánh giá IDT trình tự mồi LDLR13_F ..................................................67

Hình VI.6. Đánh giá IDT trình tự mồi LDLR13_R..................................................68

Hình VI.7. Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của trình tự mồi LDLR13_R bằng công cụ

BLAST...............................................................................................................68

Hình VI.8. Kết quả giải trình tự mẫu A1 ..................................................................71

Hình V.9. Kết quả giải trình tự mẫu A2....................................................................72

Hình V.10. Kết quả giải trình tự mẫu A3..................................................................73

Hình V.11. Kết quả giải trình tự mẫu A4..................................................................74

Hình V.12. Kết quả giải trình tự mẫu A6..................................................................75

Hình V.13. Kết quả giải trình tự mẫu A7..................................................................76