ứng dụng kỹ thuật PCR và FISH nghiên cứu biến đổi ADN ở một số thể bệnh Lơxêmi và Hemophilia A.

Bé y tÕ

B¸o c¸o kÕt qu¶ nghiªn cøu ®Ò tµi cÊp bé

øng dông kü thuËt PCR vµ fish

nghiªn cøu biÕn ®æi adn ë mét sè

thÓ bÖnh l¬ xª mi vµ hemophilia A

Chñ nhiÖm ®Ò tµi : PGS. TS. Ph¹m Quang vinh

C¬ quan chñ tr× ®Ò tµi : viÖn huyÕt häc - truyÒn m¸u TW

6872 22/5/2008

hµ néi - 2007

Bé y tÕ

B¸o c¸o kÕt qu¶ nghiªn cøu ®Ò tµi cÊp bé

øng dông kü thuËt PCR vµ fish

nghiªn cøu biÕn ®æi adn ë mét sè

thÓ bÖnh l¬ xª mi vµ hemophilia A

Chñ nhiÖm ®Ò tµi : PGS. TS. Ph¹m Quang vinh

C¬ quan chñ tr× ®Ò tµi : viÖn huyÕt häc - truyÒn m¸u TW

C¬ quan qu¶n lý : Bé Y tÕ

Thêi gian thùc hiÖn : Tõ th¸ng 10 n¨m 2003 ®Õn th¸ng 6 n¨m 2007

Tæng kinh phÝ thùc hiÖn ®Ò tµi : 260 triÖu ®ång

Trong ®ã : Kinh phÝ SNKH : 260 triÖu ®ång

hµ néi - 2007

B¸o c¸o kÕt qu¶ nghiªn cøu ®Ò tµi cÊp bé

1. Tªn ®Ò tµi: “øng dông kü thuËt PCR vµ FISH nghiªn cøu biÕn ®æi ADN

ë mét sè thÓ bÖnh L¬ xª mi vµ Hemophilia A”.

2. Chñ nhiÖm ®Ò tµi : PGS. TS. Ph¹m Quang vinh

3. C¬ quan chñ tr× ®Ò tµi : viÖn huyÕt häc - truyÒn m¸u TW

4. C¬ quan qu¶n lý ®Ò tµi : Bé Y tÕ

5. Th− ký ®Ò tµi : ThS. Vâ Thanh B×nh

6. Phã chñ nhiÖm ®Ò tµi

7. Nh÷ng ng−êi thùc hiÖn :

§¬n vÞ :

- Khoa MiÔn dÞch Di truyÒn - ViÖn HuyÕt häc - TruyÒn m¸u TW

- Khoa TÕ bµo - ViÖn HuyÕt häc - TruyÒn m¸u TW

- Khoa l©m sµng c¸c bÖnh m¸u viÖn huyÕt häc - truyÒn m¸u TW

- Khoa ®iÒu trÞ hemophilia viÖn huyÕt häc - truyÒn m¸u TW

- Phßng Sinh ho¸, Khoa Di truyÒn - Sinh häc ph©n tö

ViÖn VÖ sinh DÞch tÔ TW

C¸ nh©n :

1. PGS. TS. Ph¹m Quang Vinh - ViÖn HH-TM TW

2. PGS. TS. B¹ch Kh¸nh Hoµ - ViÖn HH-TM TW

3. CN. NguyÔn Quèc C−êng - ViÖn HH-TM TW

4. CN. TrÇn C«ng Hoµng - ViÖn HH-TM TW

5. ThS. NguyÔn ThÞ Mai - ViÖn HH-TM TW

6. ThS. Vâ Thanh B×nh - ViÖn HH-TM TW

7. ThS. NguyÔn Quang Tïng - ViÖn HH-TM TW

8. ThS. Vò Minh Ph−¬ng - ViÖn HH-TM TW

9. CN. NguyÔn Minh Ph−¬ng - ViÖn HH-TM TW

10. BSNT. NguyÔn Thiªn L÷ - ViÖn HH-TM TW

11. TS. NguyÔn H¹nh Phóc - ViÖn VSDT TW

12. TS. NguyÔn Hoµi Giang - ViÖn VSDT TW

8. C¸c ®Ò tµi nh¸nh

9. Thêi gian thùc hiÖn ®Ò tµi : Tõ th¸ng 10/2003 ®Õn th¸ng 6/2007.

ch÷ viÕt t¾t

AML ( Acute Myeloid leukemia) : L¬ xª mi cÊp dßng tuû

ALL ( Acute Lymphocytic leukemia) : L¬ xª mi cÊp dßng lympho

APL ( Acute promyelocytic leukemia) : L¬ xª mi cÊp thÓ tiÒn tuû bµo

FISH ( Fluorescense In situ Hybridization) : Kü thuËt lai huúnh quang

MDS ( Myelodysplastic syndrome) : Héi chøng rèi lo¹n sinh tuû

MLL ( Mixed Lineage leukemia) : L¬ xª mi cÊp lai tuû - lympho

PCR (polymerase chain reaction) : Ph¶n øng khuÕch ®¹i gen

RT - PCR (Reverse Trans-criptase

Polymerase chain reaction)

: Ph¶n øng khuÕch ®¹i gen ®¶o ng−îc

RFLPs ( Restriction Fragment Length

Polymorphism)

: Kü thuËt c¾t ADN b»ng enzym h¹n

chÕ

Môc lôc

Trang

PhÇn A. Tãm t¾t kÕt qu¶ næi bËt cña ®Ò tµi 1

Më ®Çu 3

Ch−¬ng 1. Tæng quan tµi liÖu 5

1.1. BÊt th−êng vËt chÊt di truyÒn vµ bÖnh m¸u 5

1.1.1. BÊt th−êng di truyÒn bÈm sinh 5

1.1.2. BÊt th−êng di truyÒn m¾c ph¶i 6

1.2. BÊt th−êng di truyÒn vµ Hemophilia 6

1.2.1. Giíi thiÖu bÖnh Hemophilia 6

1.2.2. Di truyÒn ph©n tö yÕu tè VIII 8

1.2.3. Di truyÒn bÖnh Hemophilia 9

1.2.4. C¸c tæn th−¬ng di truyÒn ë bÖnh nh©n Hemophilia A 10

1.2.5. C¸c ph−¬ng ph¸p ph¸t hiÖn ng−êi mang gen bÖnh

Hemophilia

11

1.3. BÊt th−êng di truyÒn vµ l¬ xª mi 17

1.3.1. C¬ chÕ sinh l¬ xª mi 17

1.3.2. HÖ thèng gen trong tÕ bµo liªn quan ®Õn ung th− 17

1.3.3. Ho¹t ho¸ c¸c oncogene ë bÖnh m¸u ¸c tÝnh 25

1.3.4. BÊt ho¹t gen øc chÕ u 32

1.3.5. Vai trß ph¸t hiÖn bÊt th−êng di truyÒn trong nghiªn cøu

bÖnh l¬ xª mi

33

Ch−¬ng 2. §èi t−îng vµ ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu 36

2.1. X¸c ®Þnh ng−êi mang gen Hemophilia 36

2.1.1. §èi t−îng 36

2.1.2. Ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu 36

2.2. Nghiªn cøu bÊt th−êng gen ë bÖnh nh©n l¬ xª mi h¹t kinh 40

2.2.1. §èi t−îng 40

2.2.2. Ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu 40

2.3. X¸c ®Þnh gen hçn hîp AML/ETO ë l¬ xª mi cÊp M2 vµ gen

PML/RARα ë M3

48

2.3.1. §èi t−îng 48

2.3.2. Ph−¬ng ph¸p 49

Ch−¬ng 3. KÕt qu¶ 54

3.1. Hemophilia 54

3.1.1. TØ lÖ dÞ hîp tö víi d¹ng ®a h×nh ADN cã ®iÓm c¾t víi

enzym BclI trªn intron 18 vµ HindIII trªn intron 19 cña

gen yÕu tè VIII

54

3.1.2. X¸c ®Þnh ng−êi phô n÷ mang gen bÖnh dùa vµo ph©n

tÝch kÕt qu¶ PCR-RFLPs víi BclI

58

3.2. Ph¸t hiÖn gen hçn hîp BCR/ABL ë l¬ xª mi h¹t kinh 60

3.2.1. Ph¸t hiÖn b»ng kü thuËt PCR 60

3.2.2. Ph¸t hiÖn gen hçn hîp BCR/ABL b»ng kü thuËt FISH 64

3.3. Ph¸t hiÖn gen hçn hîp ETO/AML ë M2 vµ PML/RARα ë

bÖnh nh©n M3

66

Ch−¬ng 4. Bµn luËn 68

4.1. TÝnh ®a h×nh gen Hemophilia vµ x¸c ®Þnh ng−êi mang gen

bÖnh

68

4.1.1. TØ lÖ dÞ hîp tö cña PCR-RFPs víi vÞ trÝ c¾t ®Æc hiÖu cña

BclI vµ HindIII

68

4.1.2. ¸p dông PCR-RFLPs víi BclI vµo chÈn ®o¸n ng−êi

mang gen Hemophilia A

70

4.2. Gen hçn hîp BCR/ABL vµ l¬ xª mi h¹t kinh 72

4.3. KÕt qu¶ ph©n tÝch gen ETO/AML vµ RAR/PML 75

KÕt luËn 77

Tµi liÖu tham kh¶o 79

1

PhÇn A

Tãm t¾t kÕt qu¶ næi bËt cña ®Ò tµi

Hoµn c¶nh ra ®êi vµ môc tiªu cña ®Ò tµi :

C¸c bÊt th−êng ADN lµ nguyªn nh©n cña nhiÒu bÖnh bÈm sinh, cã tÝnh

di truyÒn mµ hai bÖnh th−êng gÆp trong chuyªn khoa HuyÕt häc - TruyÒn

m¸u lµ Thalassemia vµ Hemophilia. §· cã nhiÒu c«ng tr×nh nghiªn cøu trong

n−íc vµ trªn thÕ giíi vÒ gen bÖnh g©y Thalassemia. Mét sè kÕt qu¶ ®· ®−îc

øng dông trong chÈn ®o¸n sím vµ chÈn ®o¸n tr−íc sinh.

Trong khi ®ã bÊt th−êng ADN trong Hemophilia rÊt phøc t¹p vµ ®a

d¹ng, nh÷ng hËu qu¶ cña bÖnh rÊt nÆng nÒ. Trªn thÕ giíi ®· cã nhiÒu nghiªn

cøu vÒ gen bÖnh, vÒ ph¸t hiÖn ng−êi lµnh mang gen bÖnh ®Ó cã biÖn ph¸p ®Ò

phßng. ë ViÖt Nam c«ng t¸c qu¶n lý, ch¨m sãc ng−êi bÖnh Hemophilia ch−a

thËt tèt. TÝnh chÊt di truyÒn, ®Æc ®iÓm gen di truyÒn ch−a ®−îc nghiªn cøu;

ch−a cã biÖn ph¸p hiÖu qu¶ x¸c ®Þnh ng−êi lµnh mang gen bÖnh.

Bªn c¹nh ®ã mét sè biÕn ®æi ADN trong tÕ bµo gèc t¹o m¸u cã thÓ ®−a

®Õn hËu qu¶ rèi lo¹n ph¸t triÓn vµ g©y ra bÖnh m¸u ¸c tÝnh. Mçi lo¹i bÊt

th−êng gen cã nh÷ng bÖnh c¶nh kh¸c nhau. V× vËy n¨m 2001 Tæ chøc Y tÕ

ThÕ giíi ®· ®−a ra c¸ch xÕp lo¹i bÖnh m¸u vµ c¬ quan lympho. Theo c¸ch

xÕp lo¹i nµy víi l¬ xª mi cÊp cÇn xem xÐt tr−íc hÕt lµ sù cã mÆt hay kh«ng

cña c¸c biÕn ®æi gen ®Æc tr−ng. §Ó x¸c dÞnh gen nµy cÇn thùc hiÖn kü thuËt

xÐt nghiÖm sinh häc ph©n tö.

ViÖn HuyÕt häc - TruyÒn m¸u trong nhiÒu n¨m ®· x©y dùng Trung t©m

Hemophilia vµ tæ chøc c¸c ho¹t ®éng tuyªn truyÒn vÒ ph¸t hiÖn, ch¨m sãc,

®iÒu trÞ bÖnh. Hµng n¨m sè bÖnh nh©n do ViÖn qu¶n lý cµng t¨ng lªn.

Trong nh÷ng n¨m qua ViÖn ®· triÓn khai c¸c kü thuËt chÈn ®o¸n hiÖn

®¹i nh− x¸c ®Þnh CD mµng tÕ bµo, ph©n tÝch bÊt th−êng nhiÔm s¾c thÓ trong

l¬ xª mi. ViÖn lµ c¬ së ®Çu ngµnh cña chuyªn khoa HuyÕt häc - TruyÒn m¸u

cÇn triÓn khai c¸c kü thuËt sinh häc ph©n tö ¸p dông trong chÈn ®o¸n ng−êi

2

mang gen hemophilia, chÈn ®o¸n tr−íc sinh víi bÖnh nµy. §ång thêi ViÖn

ph¶i tæ chøc sím viÖc øng dông c¸c kü thuËt chÈn ®o¸n vµ ph©n lo¹i míi theo

quèc tÕ. V× vËy ®¬n vÞ nghiªn cøu ®· ®Ò xuÊt ®Ò tµi nh»m môc ®Ých :

1. Sö dông kü thuËt PCR x¸c ®Þnh c¸c bÊt th−êng ADN ë bÖnh nh©n

hemophilia tiÕn tíi t×m ng−êi lµnh mang gen bÖnh.

2. TriÓn khai kü thuËt PCR vµ FISH trong viÖc ph¸t hiÖn mét sè gen

®Æc tr−ng ë bÖnh l¬ xª mi cÊp, l¬ xª mi h¹t kinh.

KÕt qu¶ næi bËt cña ®Ò tµi:

1. TriÓn khai ®−îc kü thuËt PCR vµ FISH ë ViÖn HuyÕt häc -

TruyÒn m¸u Trung −¬ng.

- §−a kü thuËt hiÖn ®¹i vµo ¸p dông vµ ®µo t¹o ®−îc ®éi ngò c¸n bé

kü thuËt thùc hiÖn ®−îc qui tr×nh kü thuËt xÐt nghiÖm PCR, FISH lµm c¬ së

cho viÖc øng dông ph−¬ng ph¸p sinh häc ph©n tö chÈn ®o¸n bÖnh.

- øng dông dông kü thuËt PCR - RFLPs x¸c ®Þnh ADN ®a h×nh gen

yÕu tè VIII. B−íc ®Çu x¸c ®Þnh tû lÖ dÞ hîp tö cña d¹ng ®a h×nh ADN c¾t

b»ng enzym BclI lµ 48% ë phô n÷ b×nh th−êng. §©y lµ tû lÖ cã ý nghÜa ®Ó

gióp ph¸t hiÖn ng−êi mang gen Hemophilia A.

- øng dông ®−îc kü thuËt PCR vµ kü thuËt FISH ®Ó x¸c ®Þnh gen hçn

hîp ABL/BCR ë l¬ xª mi kinh dßng tñy . øng dông kü thuËt RT PCR ph¸t

hiÖn gen AML/ETO vµ RAR/PML ë l¬ xª mi cÊp dßng tñy, tiÕn tíi gãp phÇn

ph©n lo¹i l¬ xª mi.

2. X©y dùng ®−îc qui tr×nh sö dông kü thuËt PCR x¸c ®Þnh ng−êi

lµnh mang gen trong gia ®×nh bÖnh nh©n Hemophilia A vµ ®· ¸p dông ®Ó

ph¸t hiÖn ®−îc 2 ng−êi lµnh mang gen bÖnh, x¸c ®Þnh 7 ng−êi kh«ng mang

gen bÖnh.

3. §µo t¹o:

- Mét luËn v¨n néi tró (®· b¶o vÖ)

- Lµm c¬ së mét luËn ¸n Nghiªn cøu sinh

3

Më ®Çu

BÖnh m¸u lµ c¸c bÖnh liªn quan ®Õn tÕ bµo m¸u, c¬ quan t¹o m¸u vµ

hÖ thèng cÇm, ®«ng m¸u.

TÕ bµo m¸u vµ c¬ quan t¹o m¸u ho¹t ®éng, sinh s¶n, bÖnh ho¸ thùc

chÊt lµ qu¸ tr×nh ho¹t ®éng cña hÖ thèng gen - protein. C¸c yÕu tè tham gia

vµo cÇm, ®«ng m¸u còng lµ protein - ®ã lµ s¶n phÈm cña tÕ bµo th«ng qua

ho¹t ®éng gen - protein.

Nh− vËy, dï thuéc lo¹i bÖnh nµo ®Òu cã liªn quan ®Õn ho¹t ®éng cña

gen - protein.

C¸c kü thuËt sinh häc ®Æc biÖt lµ kü thuËt sinh häc ph©n tö ph¸t triÓn

®· cã ®ãng gãp trong viÖc chÈn ®o¸n nhiÒu bÖnh vµ ph¸t hiÖn nhiÒu t¸c nh©n

g©y bÖnh.

Nh÷ng bÖnh m¸u liªn quan ®Õn vËt chÊt di truyÒn cã thÓ lµ do bÈm

sinh: hÖ thèng gen ®· bÞ tæn th−¬ng ngay khi c¬ thÓ ®−îc h×nh thµnh, c¸c tÕ

bµo cña c¬ thÓ ®Òu mang gen bÊt th−êng. Thuéc nhãm nµy cã rÊt nhiÒu bÖnh

nh−ng 2 lo¹i bÖnh hay gÆp lµ thalassemia vµ hemophilia. Còng cã thÓ bÊt

th−êng vËt chÊt di truyÒn x¶y ra ë 1 tÕ bµo gèc t¹o m¸u vµ t¹o ra c¸c tÕ bµo

con ch¸u mang bÊt th−êng nµy. Cã nhiÒu bÊt th−êng g©y rèi lo¹n ph¸t triÓn tÕ

bµo mµ ®iÓn h×nh lµ bÖnh ¸c tÝnh c¬ quan t¹o m¸u.

Trªn thÕ giíi c¸c nghiªn cøu ph¸t hiÖn bÊt th−êng vËt chÊt di truyÒn

(ADN) trong c¸c bÖnh thalassemia, hemophilia vµ bÖnh ¸c tÝnh hÖ t¹o m¸u ®·

®−îc thùc hiÖn ë c¸c trung t©m vµ c¸c n−íc ph¸t triÓn, ®ang ph¸t triÓn. KÕt

qu¶ nghiªn cøu ®−îc øng dông trong chÈn ®o¸n vµ phßng ngõa bÖnh

Hemophilia, Thalassemia. Riªng ®èi víi bÖnh m¸u, Tæ chøc Y tÕ ThÕ giíi ®·

®Ò nghÞ xÕp lo¹i tr−íc hÕt c¨n cø vµo bÊt th−êng di truyÒn [21].