Ứng dụng kỹ thuật AS-REAL-TIME-PCR nhằm phát hiện một số đột biến nổi trội trên gene K-RAS

1

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN

THAM GIA XÉT GIẢI THƯỞNG CẤP TRƯỜNG

Tên đề tài:

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT AS-REAL-TIME PCR

NHẰM PHÁT HIỆN MỘT SỐ ĐỘT BIẾN NỔI TRỘI

TRÊN GEN K-RAS: ĐÍCH NHẮM TRONG ĐIỀU TRỊ

UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH - SINH HỌC PHÂN TỬ

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 4 năm 2013

2

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN

THAM GIA XÉT GIẢI THƯỞNG CẤP TRƯỜNG

Tên đề tài:

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT AS-REAL-TIME PCR NHẰM

PHÁT HIỆN MỘT SỐ ĐỘT BIẾN NỔI TRỘI TRÊN GEN K￾RAS: ĐÍCH NHẮM TRONG ĐIỀU TRỊ UNG THƯ ĐẠI

TRỰC TRÀNG

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH - SINH HỌC PHÂN TỬ

Sinh viên thực hiện 1: NGUYỄN VĂN TRƯỜNG (Nhóm trưởng)

Nam, Nữ: Nam Năm: 03/04 Lớp SH10A2

Sinh viên thực hiện 2: NGUYỄN THỊ THÚY TÀI

Nam, Nữ: Nữ Năm: 03/04 Lớp SH10A2

Sinh viên thực hiện 3: VÕ THỊ NGHĨA

Nam, Nữ: Nữ Năm: 03/04 Lớp SH10A2

Sinh viên thực hiện 4: ĐOÀN HUỲNH SANG

Nam, Nữ: Nam Năm: 03/04 Lớp SH10A1

GVHD: PGS.TS. LÊ HUYỀN ÁI THÚY

3

MỤC LỤC:

ĐẶT VẤN ĐỀ................................................................................. 15

PHẦN I: MỞ ĐẦU ........................................................................ 17

I. TỔNG QUAN........................................................................................ 17

1. Tổng quan về ung thư..................................................................................17

2. Tổng quan về ung thư đại trực tràng (colorectal cancer): ...........................18

3. Phương pháp chẩn đoán ung thư đại trực tràng (Institute, 2011):...............21

4. Tổng quan về điều trị nhắm trúng đích trong ung thư: ...............................22

5. Tổng quan về đột biến:................................................................................26

6. Tổng quan về gen EGFR.............................................................................26

7. Tổng quan về gen K-ras ..............................................................................28

8. Kỹ thuật AS-PCR và AS-Real-time PCR....................................................30

PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .............................. 31

I. VẬT LIỆU ............................................................................................ 31

II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU....................................................... 31

1. Khai thác dữ liệu và khảo sát in silico.........................................................31

1.1. Khai thác dữ liệu...................................................................................31

1.2. Khảo sát in silico...................................................................................31

2. Khảo sát in vitro ..........................................................................................32

2.1. Tách chiết DNA....................................................................................32

2.1.1. Nguyên tắc.........................................................................................32

2.1.2. Thiết bị và hóa chất ...........................................................................33

2.1.3. Các bước tiến hành............................................................................33

2.2. Kiểm tra chất lượng DNA thu nhận: ....................................................34

2.2.1. Nguyên tắc:........................................................................................34

2.2.2. Thiết bị và hóa chất ...........................................................................34

2.2.3. Các bước tiến hành:...........................................................................34

2.3. Phản ứng PCR:......................................................................................34

2.3.1. Thiết bị, hóa chất:..............................................................................35

2.3.2. Các bước tiến hành:...........................................................................35

2.4. Phương pháp điện di:............................................................................36

2.4.1. Nguyên tắc:........................................................................................36

2.4.2. Thiết bị hóa chất:...............................................................................36

2.4.3. Các bước tiến hành:...........................................................................36

4

2.5. Phản ứng Real time PCR ......................................................................36

2.5.1. Thiết bị, hóa chất:..............................................................................36

2.5.2. Các bước tiến hành:...........................................................................36

PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ..................................... 38

I. KẾT QUẢ KHAI THÁC DỮ LIỆU VÀ KHẢO SÁT IN SILICO ... 38

1. Khai thác dữ liệu - Các loại đột biến trên gen K-ras...................................38

2. Kết quả khảo sát in silico.............................................................................46

2.1. Thu nhận trình tự gen, định vị các vị trí đột biến đã công bố: .............46

2.2. Thiết kế và đánh giá mồi cho phản ứng PCR-Giải trình tự, AS-PCR..47

2.2.1. Thiết kế mồi: .....................................................................................47

2.2.2. Đánh giá mồi .....................................................................................47

II. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM:............................................................. 51

1. Tách chiết DNA và kiểm tra DNA bộ gen sau tách chiết: ..........................51

2. Thử nghiệm các điều kiện phản ứng cho PCR – giải trình tự:....................54

3. Kết quả thử nghiệm PCR-giải trình tự phát hiện đột biến trên gen K-ras từ

các bệnh nhân ung thư đại trực tràng: ................................................................56

4. Kết quả thử nghiệm Alelle-Specific PCR phát hiện đột biến trên gen K-ras từ

các bệnh nhân ung thư đại trực tràng: ................................................................61

PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................... 65

I. KẾT LUẬN........................................................................................... 65

II. KIẾN NGHỊ.......................................................................................... 65

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................ 66

PHỤ LỤC ....................................................................................... 69

PHỤ LỤC 1: ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG VÀ GIẢI PHẨU BỆNH CỦA 19 MẪU

ĐẠI TRỰC TRÀNG ..................................................................................... 69

PHỤ LỤC 2: PHÂN TÍCH KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ CỦA 19 MẪU ĐẠI

TRỰC TRÀNG VÀ 1 MẪU VÚ .................................................................... 70

5

DANH MỤC HÌNH:

Hình 1.1. Thể hiện tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ tử vong trên toàn thế giới (Globocan,

2008)

Hình 1.2. Tỷ lệ mắc bệnh ung thư đại trực tràng ở nam giới trên thế giới (Globocan,

2008)

Hình 1.3. Tỷ lệ mắc bệnh ung thư đại trực ràng ở nữ giới trên thế giới (Globocan,

2008)

Hình 1.4. Tỷ lệ mắc bệnh ung thư đại trực tràng ở nam giới tại Việt Nam (Globocan,

2008)

Hình 1.5. Tỷ lệ mắc bệnh ung thư đại trực tràng ở nữ giới tại Việt Nam (Globocan,

2008)

Hình 1.6. Các loại thuốc điều trị nhắm trúng đích thụ thể EGFR (Krause D. S, 2005)

Hình 1.7. Vị trí gen EGFR trên NST số 7

Hình 1.8. Cấu trúc thụ thể EGFR (Siwak D. R, 2009)

Hình 1.9. Vị trí gen K-Ras trên NST số 12

Hình 1.10. Thụ thể EGFR và con đường Ras. (Arrington A. K, 2012)

Hình 3.1. Tỷ lệ đột biến của bảy vị trí phổ biến trên gen K-ras đã qua áp dụng

cách thống kê, tính tần số trung bình có trọng số

Hình 3.2. Mô hình cấu trúc domain của protein K-ras (A) và vị trí các đột biến trên

gen (B)

Hình 3.3. Vị trí cặp mồi phản ứng PCR khuếch đại exon 1 gen K-ras

Hình 3.4. Vị trí bắt cặp của các mồi (trong phản ứng AS-PCR) và các mồi/mẫu dò

(trong phản ứng AS Real-time PCR)

Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi K-ras trên 2 mẫu bệnh phẩm 9

và 16. Thang chuẩn 100 bp

Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm PCR thử nghiệm tối ưu hóa nồng độ DNA và

nồng độ mồi K-ras. Thang chuẩn 100 bp.

Hình 3.7. Kết quả điện di sản phẩm PCR dò tìm Tm tối thích cho cặp mồi K-ras.

Thang chuẩn 100 bp.

Hình 3.8. Một số vị trí nghi ngờ đột biến phát hiện được bằng phương pháp giải trình

tự

Hình 3.19. Kết quả giải trình tự codon 12 và 13 trên các mẫu

Hình 3.10. Mẫu 33 với tín hiệu nền bị nhiễu

Hình 3.11. Kết quả điện di sản phẩm AS-PCR trên ba mẫu 18, 20 và 16.

Hình 3.12. Kết quả điện di sản phẩm AS-PCR trên ba mẫu 4, 7 và 20 (sau điện di

trong điện trường 75 V, thời gian 30 phút)

Hình 3.13. Kết quả điện di sản phẩm AS-PCR trên ba mẫu 4, 7 và 20 (sau điện di

trong điện trường 75 V, thời gian 50 phút)

6

Hình 3.14. Kết quả AS Real-time PCR phát hiện đột biến G12A âm tính trên tất cả

các mẫu thử nghiệm

Hình 3.15. Kết quả AS Real-time PCR dương tính trên hai mẫu 1 và 16

7

DANH MỤC BẢNG:

Bảng 2.1. Thành phần phản ứng PCR với K-ras

Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR với K-ras

Bảng 2.3. Thành phần phản ứng Real time PCR với mồi đột biến

Bảng 2.4. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng Real time PCR với mồi đột biến

Bảng 3.1. Tỷ lệ đột biến gen K-ras trên ung thư đại trực tràng

Bảng 3.2. Tỷ lệ đột biến gen EGFR trên các loại ung thư

Bảng 3.3. Các loại mẫu được sử dụng trong các tài liệu tham khảo

Bảng 3.4. Tỷ lệ đột biến bảy vị trí phổ biến trên gen K-ras

Bảng 3.5. Sự thay đổi nu (nu được gạch dưới) ở codon 12 và 13 dẫn đến các đột

biến

Bảng 3.6. Phân tích ANOVA trên các khác biệt về cỡ mẫu ở các châu khác nhau

về 7 kiểu đột biến nổi trội trên gen K-ras

Bảng 3.7. Trình tự và các thông số đánh giá mồi của IDT cho phản ứng PCR khuếch

đại exon 1 gen K-ras

Bảng 3.8. Trình tự và các thông số đánh giá mồi của IDT cho phản ứng AS-PCR và

AS Real-time PCR phát hiện 7 đột biến nổi trội trên exon 1 gen K-ras

Bảng 3.9. Chỉ số OD của 3 mẫu 5, 16, 17

Bảng 3.10. Kết quả đo mật độ quang của lô mẫu thử nghiệm phương pháp tách chiết

mới

Bảng 3.11. Ký hiệu các đột biến phát hiện được

Bảng 3.12. Tổng số đột biến trên các mẫu

8

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

A : Adenine

ANOVA : Analysis of value

AS-PCR : Allele-specific Polymerase Chain Reaction

AS-Real-Time PCR : Allele-specific Real Time Polymerase Chain Reaction

ATP : Adenosine triphosphate

ADP : Adenosine diphosphate

BCR : Breakpoint cluster region

BLAST : Basic Local Alignment Search Tool

bp : base pair

C : Cytosine

COLD-PCR : Coamplification at Lower Denaturation temp PCR

DNA : Deoxyribonucleic acid

EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid

EGF : Epidermal Growth Factor

EGFR : Epidermal Growth Factor Receptor

ErbB : V-erb-b2 erythroblastic leukemia viral oncogene homolog

FISH : Fluorescent in situ hybridization

G : Guanidine

Grb2 : Growth factor receptor-bound protein 2

HRM : High Resolution Melting

K-ras : Kirsten-ras/ V-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene

homolog

LNA-PCR : Locked nucleic acid PCR

MAPK : Mitogen Activated Protein kinase

MEK : Mitogen Activated Protein kinase kinase

NCBI : National Center for Biotechnology Information

OD : Optical Density

PCR : Polymerase Chain Reaction